Spherical Supported Lipid Bilayer Assay: 마이크로스피어에서 Septin 어셈블리를 관찰하는 기술

초록

출처: Curtis, BN et al., 생물물리학적 특성 및 기능을 연구하기 위해 멤브레인에서 셉틴 어셈블리의 재구성. J. Vis. 특급 (2022).

이 비디오는 지질 이중층으로 코팅된 미세구에서 셉틴 단백질 어셈블리를 연구하는 기술을 설명합니다. 이 기술은 곡면에 있는 단백질의 곡률 의존적 어셈블리를 이해하는 데 도움이 됩니다.

프로토콜

1. 구형 지지 지질 이중층

참고: 이 프로토콜은 10% 밀도의 초순수에 부유하는 실리카 마이크로스피어를 사용합니다. 단백질 어셈블리의 kinetic parameter에 대한 모든 작업을 위해서는 실험과 곡률 사이의 총 멤브레인 표면적을 엄격하게 제어하는 것이 중요합니다.표 1은 총 멤브레인 표면적의 5mm2를 유지하기 위해 보정된 비드 및 버퍼의 부피를 보여줍니다.

1. 이중층 형성
   메모: 평면 이중층의 경우 견고한 이중층 형성을 위해 고품질 SUV를 보유하는 것이 중요합니다. 표 1에는 10% 밀도 용액의 비드 부피와 다양한 비드 직경에 대해 5mm²의 최종 표면적을 얻는 데 사용되는 각각의 SLBB 부피가 나열되어 있습니다.
   1. 실리카 미세구체 (또한 구슬로 불리는)는 함께 침전하고 뭉치는 경향이 있다; 구슬을 섞고 어떤 송이든지 끊기 위하여는, 15 s 동안 병을 와류로 돌린 후에, 그 후에 1 분 동안 목욕 sonicate, 그리고 15 초 동안 다시 와류.
   2. 0.5mL 저접착 마이크로 원심분리기 튜브에 적절한 부피의 비드(표 1)와 해당 부피의 SLBB 및 10μL의 5mM SUV를 혼합합니다.
   3. 비드-지질 혼합물을 실온에서 1시간 동안 끝단 넘게 흔듭니다. 이 배양은 침전을 방지하기 위해 회전자에서 수행되어야 합니다.
2. PEGylated coverslips에 챔버를 준비합니다
   메모: 평면 이중층의 경우 반응 부피를 지원하기 위해 플라스틱 PCR 튜브의 수제 챔버가 사용되지만 실리콘 웰과 같은 다른 저접착 물질도 잘 작동할 수 있습니다.
   1. 구슬이 흔들리는 동안 PEGylated 커버슬립을 실온에서 해동합니다. 0.2mL PCR 튜브를 자르고 설명된 대로 커버슬립에 붙입니다. 24mm x 50mm 슬라이드의 경우 하나의 슬라이드에 최대 10개의 챔버를 수용할 수 있습니다.
      메모: 이 프로토콜은 사전에 준비된 24mm x 50mm PEGylated glass coverslip을 사용합니다. 간단히 말해서, 유리 커버 슬립은 아세톤, 메탄올 및 3M KOH의 초음파 처리를 통해 철저히 청소됩니다. 그런 다음 커버슬립은 n-2-aminoethyl-3-aminopropyltrimethoxysilane으로 기능화되고 mPEG 숙시니미딜 발레레이트에 공유 연결됩니다. 완성되는 PEGylated coverslips는 -80 °C에 진공 밀봉된 보관됩니다. 여기에는 PEGylated glass coverslips가 제안되어 있지만 BSA 또는 poly-L-lysine 방법과 같은 다른 패시베이션 수단이 효과적일 수 있습니다.
3. 과도한 지질 씻어내기
   메모: 이 단계는 과도한 SUV를 제거하고 버퍼 교환을 수행하는 기능을 합니다. 비드는 사전 반응 완충액(PRB: 33.3 mM KCl, 50 mM HEPES, pH 7.4)으로 총 4배 세척됩니다.표 2는 다양한 비드 직경에 대한 RCF의 회전 속도를 나열합니다.
   1. 지정된 RCF에서 30초 동안 비드를 돌립니다(표 2). 여러 크기의 구슬을 사용하는 경우 세척할 때가 될 때까지 구슬을 흔들어 두십시오.
      메모: 시간을 절약하기 위해 더 작은 비드 침강 속도를 가진 더 작은 비드와 동일한 스핀으로 더 큰 비드를 침전하는 것은 가치가 없습니다. 이로 인해 비드가 서로 달라붙어 이중층의 무결성이 손상될 수 있습니다.
   2. 첫 번째 탈수 후 상등액 50μL를 제거하고 PRB 200μL를 추가합니다. 두 번째 및 세 번째 회전 후 200μL를 제거하고 200μL의 PRB를 추가합니다. 네 번째 회전 후 200μL를 제거하고 220μL의 PRB를 추가합니다. 세탁할 때마다 격렬하게 피펫을 삐걱거립니다.
      메모: 최종 재현탁액은 세척량과 다릅니다. 지질과 함께 배양 한 후 비드를 와류로 만들지 마십시오.이 경우 이중층에 틈이 생길 수 있습니다. 다른 bead 크기로 작업하거나 assay의 다른 부분을 설정하는 동안 침강을 방지하려면 bead mixtures를 end-over-end rotator에 다시 놓습니다.
4. 반응 준비
   1. 여러 bead 크기로 경쟁 분석을 수행하는 경우 각 bead size를 동일한 부피로 혼합하여 1:1 혼합물을 만듭니다. 그런 다음 원하는 비드 혼합물 29μL와 원하는 비드 혼합물(또는 단일 비드)을 RXN 완충액 721μL와 혼합합니다.
      메모: 조밀한 비드 클러스터를 피하기 위해 각 단계에서 비드를 피펫과 철저히 혼합하는 것이 중요합니다. 이렇게 하면 비드가 더 고르게 분포되고 총 표면적이 정확해집니다.
   2. 75μL의 희석된 비드와 SSB에 희석된 25μL의 단백질을 wells.
      에 혼합합니다. 메모: 저자는 일반적으로 1-50nM에서 효모 셉틴 복합체를 이미지화합니다.
   3. 정상 상태에서 셉틴을 측정하는 경우 실온에서 1시간 동안 배양한 다음 NIRF에 가까운 현미경 또는 컨포칼 현미경으로 이미지화합니다.
      메모: 이 반응은 5^mm2에서 반응의 총 멤브레인 표면적을 보존하고 100 mM KCl, 50 mM HEPES, 1 mg/mL BSA, 0.1% 메틸셀룰로오스 및 1 mM BME의 최종 반응 조건을 생성하도록 설계되었습니다.

표 1: 마이크로스피어의 정규화된 부피. 각 비드 크기의 동일한 표면적을 유지하고 실험 간에 총 멤브레인 표면적을 일관되게 유지하기 위해 총 표면적을 정규화한 각 비드 크기 및 버퍼의 부피를 계산했습니다.

님 호 분 월 의 분 호 년 님 분 호 호 분 호 아네트웍스 분 호 분

비드 직경(μm)	잘 혼합된 비드의 부피(μL)	SLB 버퍼의 부피(μL)	SUV의 부피 (μL)
6.46	8.94	61.1	10
5.06	7	63	10
3.17	4.39	65.6	10
0.96	1.33	68.7	10
0.54	0.75	69.3	10
0.31	0.43	69.6	10

표 2: 다양한 직경의 마이크로스피어에 대한 침강 속도. 각 비드 직경에 대해 표시된 최소 침강 속도를 사용하여 결합되지 않은 리포좀을 씻어내기 위해 비드를 펠릿화했습니다

호 호 호 월

비드 직경(μm)	침강 속도(RCF)
0.31	4.5
0.54	4.5
0.96	2.3
3.17	0.8
5.06	0.3

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
0.2 mL PCR 튜브(플랫 캡 포함), 내추럴	왓슨	137-211C(예)
0.5 mL 저접착 튜브	미국 과학	1405-2600
베타 메르캅토에탄올(BME)	시그마-알드리치	M6250-100ML
소 혈청 알부민(BSA)	시그마-알드리치	A4612-25G
PEGylated 커버슬립 제작을 위한 커버글라스	써모 사이언티픽(Thermo Scientific	152450	Richard-Allan Scientific SLIP-RITE 커버 글라스 24x50 #1.5
증권 시세	Avanti 극성 지질	850375
에그 리스 로다민 PE	Avanti 극성 지질	810146
헤페스	시그마 알드리치	H3375-1KG
메틸 셀룰로오스 4000cp	시그마-알드리치	M052-100지
소형 분리기
Non-Functionalized Silica Microspheres (비기능성 실리카 마이크로스피어)	뱅스 연구소, Inc.	크기에 따라 다름: SS0200*-SS0500*	수성 현탁액에 있는 실리카
광학 접착제	놀랜드 톨랩스	NOA 68	유리 또는 플라스틱을 위한 유연한 접착제
염화칼륨	폭스바겐	0395-1킬로그램
초음파 발생기 욕조	브 랜 슨	1510R-MT	브랜소닉 초음파 세척기. 50-60Hz. 출력: 70W
소이 PI	Avanti 극성 지질	840044
탁상용 원심분리기	에펜도르프	22331
UV 램프	스펙트롤린	ENF-260C	115볼트, 60Hz, 0.20암페어

년 ) 년 표시기 호 영어