alamarBlue Assay: 인간 각막 상피 세포의 대사 활성에 대한 인공 눈물 제형의 세포 독성 효과를 스크리닝하는 민감한 형광 측정 방법

초록

출처: Rangarajan, R. et al. 건조에 노출 된 후 인간 각막 상피 세포의 대사 활성에 대한 인공 눈물 제형의 효과. J. Vis. 특급 (2020년)

이 비디오는 레사주린 기반 알라마르 블루 용액을 사용하여 각막 상피 세포의 세포 대사 활성에 대한 인공 눈물 제형의 효과를 평가하기 위한 체외 형광 분석에 대해 설명합니다. 무독성 제형은 세포를 건강하고 대사적으로 활성화된 상태로 유지하여 레사주린을 고형광 레소루핀으로 환원시키는 것을 촉진합니다.

프로토콜

1. 인간 각막 상피 세포 배양

1. 37°C에서 5% CO₂.
   로 10% 소 태아 혈청(FBS) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신을 함유한 Dulbecco의 변형된 Eagle 배지/영양 혼합물 F-12(DMEM/F12) 20mL를 사용하여 콜라겐 코팅된 75cm² 플라스크에서 불멸의 HCEC를 성장시킵니다. 참고: 흔들 필요가 없습니다.
2. 2-3일마다 미디어를 교체하십시오.

2. 테스트용 셀 준비

1. 세포가 거의 합류한 후 배양 배지를 제거합니다.
2. 각 75cm² 플라스크에 4−6mL의 세포 분리 용액을 추가합니다. 세포가 분리될 때까지(약 20-30분) 37°C에서 세포를 배양하고 주기적으로 현미경으로 확인합니다.
3. 각 75cm² 플라스크에 10% FBS가 포함된 DMEM/F12 2-6mL를 추가합니다.
4. 플라스크의 내용물을 50mL 원심분리 튜브로 옮깁니다.
5. 450−500 x g에서 5분 동안 세포를 원심분리하고 상층액을 피펫으로 빼내고 예열된 배지에 세포를 재현탁합니다.
6. 혈구계를 사용하여 세포를 세십시오. 총 1 x 10⁵ 셀을 포함하는 미디어의 부피를 계산합니다.
7. 1 x 10⁵ 세포를 48-well collagen-1 코팅된 배양 플레이트의 각 well에 추가합니다. 웰 내 배지의 최종 부피가 10% FBS.
   0.5mL의 배양 DMEM/F12가 되도록 웰에 충분한 배지를 추가합니다. 참고: 인공 눈물 제제는 HCEC의 대사 활성 감소로 측정할 수 있는 세포 독성을 유발할 수 있습니다. 데이터의 일관성은 파종 시 각 웰에 동일한 수의 HCEC를 추가하느냐에 따라 달라집니다. 48웰 플레이트에 권장되는 배양 농도는 1 x 10⁵입니다. 포유류 세포는 재현탁 후 원심분리 튜브에 침전할 수 있기 때문에 세포 현탁액이 HCEC를 균등하게 분포하도록 플레이트에 세포를 파종하는 동안 자주 교반으로 세포를 재현탁하는 것이 좋습니다.
8. 37 ° C 및 5 % CO₂에서 24 시간 동안 세포를 배양합니다.

3. 건조 프로토콜 없음

1. 제어 절차
   1. 24시간 배양 후 플레이트에서 배양 배지를 제거합니다.
   2. 150 μL의 테스트 제형 및 매체 제어 용액으로 즉시 처리하십시오.
   3. 37 ° C 및 5 % CO₂에서 30 분 동안 세포를 배양합니다.
   4. 셀에서 테스트 용액을 제거합니다.
   5. 대사 활성을 테스트하기 위해 0.5mL의 10% 대사 염료 용액을 추가합니다. 37 ° C 및 5 % CO₂에서 4 시간 동안 세포를 더 배양합니다.
   6. 4시간의 배양 기간이 지난 후 각 웰에서 100μL의 대사 염료 용액을 제거하고 각 100μL를 96웰 플레이트의 웰에 넣습니다.
   7. 형광판 판독기(Table of Materials)를 사용하여 각 웰의 형광을 측정합니다. 여기 파장을 540nm로 설정하고 방출 파장을 590nm로 설정합니다.
2. 건조 프로토콜 없음(회수 절차)
   1. 3.1.1-3.1.4 단계를 반복합니다.
   2. 각 웰에 0.5mL의 DMEM/F12 매체를 추가합니다.
   3. 37 ° C 및 5 % CO₂에서 18 시간 동안 한 세트의 배양물을 배양합니다.
   4. 배지를 제거하고 0.5mL의 10% 대사 염료 용액을 추가합니다. 3.1.6 및 3.1.7단계를 반복합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
96웰 플레이트	코스타	3370
알라마르블루	피셔 사이언티픽	달 1025
Corning 48웰 플레이트	코 닝	354505	이것은 BioCoat 브랜드의 콜라겐 코팅입니다.
L-글루타민 및 15mM HEPES를 함유한 DMEM/F12	지브코	11039-021	이 매체에는 페놀 레드가 없습니다
소 태아 세럼	하이콘	SH30396.03
인간 각막 상피 세포	오타와 대학교	해당 사항 없음	M. Griffith 박사(캐나다 오타와 안과 연구소)의 SV40 불멸화 인간 각막 상피 세포는 Griffith M, Osborne R, Munger R, Xiong X, Doillon CJ, Laycock NL, Hakim M, Song Y, Watsky MA를 특성화했습니다. 세포주에서 구성된 기능적 인간 각막 등가물. 과학. 1999; 286:2169–72.
TrypLE Express(세포 분리 솔루션)	피셔 사이언티픽	12605036
사이테이션 5	(주)바이오텍	CYT5MPV	280 - 700 nm에서 형광을 판독할 수 있습니다(분석의 경우 540/590).