alamarBlue Assay: 인간 각막 상피 세포의 대사 활성에 대한 인공 눈물 제형의 세포 독성 효과를 스크리닝하는 민감한 형광 측정 방법

초록

출처: Rangarajan, R. et al. 건조에 노출 된 후 인간 각막 상피 세포의 대사 활성에 대한 인공 눈물 제형의 효과. J. Vis. 특급 (2020년)

이 비디오는 레사주린 기반 알라마르 블루 용액을 사용하여 각막 상피 세포의 세포 대사 활성에 대한 인공 눈물 제형의 효과를 평가하기 위한 체외 형광 분석에 대해 설명합니다. 무독성 제형은 세포를 건강하고 대사적으로 활성화된 상태로 유지하여 레사주린을 고형광 레소루핀으로 환원시키는 것을 촉진합니다.

프로토콜

1. 인간 각막 상피 세포 배양

1. 37°C에서 5% CO₂.
   로 10% 소 태아 혈청(FBS) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신을 함유한 Dulbecco의 변형된 Eagle 배지/영양 혼합물 F-12(DMEM/F12) 20mL를 사용하여 콜라겐 코팅된 75cm² 플라스크에서 불멸의 HCEC를 성장시킵니다. 참고: 흔들 필요가 없습니다.
2. 2-3일마다 미디어를 교체하십시오.

2. 테스트용 셀 준비

1. 세포가 거의 합류한 후 배양 배지를 제거합니다.
2. 각 75cm² 플라스크에 4−6mL의 세포 분리 용액을 추가합니다. 세포가 분리될 때까지(약 20-30분) 37°C에서 세포를 배양하고 주기적으로 현미경으로 확인합니다.
3. 각 75cm² 플라스크에 10% FBS가 포함된 DMEM/F12 2-6mL를 추가합니다.
4. 플라스크의 내용물을 50mL 원심분리 튜브로 옮깁니다.
5. 450−500 x g에서 5분 동안 세포를 원심분리하고 상층액을 피펫으로 빼내고 예열된 배지에 세포를 재현탁합니다.
6. 혈구계를 사용하여 세포를 세십시오. 총 1 x ....

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
96웰 플레이트	코스타	3370
알라마르블루	피셔 사이언티픽	달 1025
Corning 48웰 플레이트	코 닝	354505	이것은 BioCoat 브랜드의 콜라겐 코팅입니다.
L-글루타민 및 15mM HEPES를 함유한 DMEM/F12	지브코	11039-021	이 매체에는 페놀 레드가 없습니다
소 태아 세럼	하이콘	SH30396.03
인간 각막 상피 세포	오타와 대학교	해당 사항 없음	M. Griffith 박사(캐나다 오타와 안과 연구소)의 SV40 불멸화 인간 각막 상피 세포는 Griffith M, Osborne R, Munger R, Xiong X, Doillon CJ, Laycock NL, Hakim M, Song Y, Watsky MA를 특성화했습니다. 세포주에서 구성된 기능적 인간 각막 등가물. 과학. 1999; 286:2169–72.
TrypLE Express(세포 분리 솔루션)	피셔 사이언티픽	12605036
사이테이션 5	(주)바이오텍	CYT5MPV	280 - 700 nm에서 형광을 판독할 수 있습니다(분석의 경우 540/590).

년 년 .