타겟 유전자의 Indel 돌연변이 검출을 위한 디지털 액적 중합효소 연쇄 반응

초록

출처: Carballar-Lejarazú, R., et al. 유전자 변형 아노펠린 모기 개체군에서 indels 돌연변이를 감지하기 위한 디지털 방울 PCR. J. Vis. 특급. (2021).

이 동영상은 DNA 샘플에서 indel 돌연변이를 식별하는 데 있어 디지털 액적 중합효소 연쇄 반응의 역할을 보여줍니다. ddPCR의 높은 정밀도와 감도는 낮은 수준에서도 샘플에 존재하는 희귀 돌연변이를 정확하고 일관되게 검출할 수 있습니다. 게놈의 여러 영역에서 indel 돌연변이를 식별하고 정량화할 수 있으며, 이를 통해 돌연변이의 메커니즘과 이러한 돌연변이의 기능적 결과에 대한 귀중한 통찰력을 얻을

수 있습니다.

프로토콜

1. ddPCR 반응 및 액적 생성 준비

1. 형광측정기를 사용하여 DNA를 정량화합니다.
   메모: drop-off assay의 경우, 반응당 3,000-30,000 반수체 게놈 사본 범위를 사용하는 것이 좋으며, 이는 표적 절단 부위의 WT 염기서열에 결합하고 표적 부위에 결실 또는 삽입이 있는 경우 어닐링(drop-off)하지 않는 HEX 표지 프로브로 NHEJ 이벤트를 검출하도록 설계되었습니다. NHEJ 변형이 있음을 나타냅니다.
2. 추출물 내 DNA의 반수체 게놈 무게와 농도를 사용하여 복제 수를 계산합니다. 이것은 추출된 DNA의 농도에 총 DNA 질량을 얻는 데 사용된 부피를 곱한 다음 반수체 게놈 무게로 나누어 수행됩니다. 추가된 부피가 1-10 μL 사이인지 확인합니다. 권장 반수체 게놈 복사 범위에 있도록 필요에 따라 희석합니다.
   메모: 하나의 Anopheles gambiae 반수체 게놈은 성체 모기 당 0.27pg로 추정됩니다.
3. 프라이머 및 프로브를 설계합니다. gRNA 타겟 부위의 5'- 및 3' 말단 측면에 있는 55-60 °C 범위의 프라이머 용융 온도(Tm)로 정방향 및 역방향 올리고뉴클레오티드 프라이머를 설계하여 150-400 bp의 앰플리콘을 생성합니다.
   1. NHEJ 검출을 위한 HEX(Hexachloro-fluorescein) 표지 프로브: 표적 부위를 보완하는 ~15-20bp 길이의 올리고뉴클레오티드를 설계하고 5' 말단에 HEX-프로브를 추가하고 3' 말단에 BHQ1(BLack Hole Quencher 1)을 추가합니다. 가수분해 프로브의 Tm은 프라이머의 Tm보다 3-10°C 높아야 합니다.
   2. 참조 WT에 대한 FAM(6-carboxyfluorescein) 표지 프로브: 표적 부위에서 멀리 떨어진 보존된 게놈 부위(약 25bp)에 상보적인 길이의 올리고뉴클레오타이드~15-20bp를 설계하고 FAM-프로브를 5'-말단에, BHQ1을 3' 말단에 추가합니다. 가수분해 프로브의 Tm은 프라이머의 Tm보다 3-10°C 높아야 합니다.

2. PCR 반응 준비

1. 프로브용 ddPCR 슈퍼믹스(UTP 없음): 12.5 μL, 정방향 및 역방향 프라이머(10 μM): 각각 1 μL, HEX/FAM 프로브(10 μM): 각각 0.625 μL, DNA: 1-5 μL(3,750-37,500 반수체 게놈 사본) 및 물: 최대 25 μL.
2. 와류 또는 환류 피펫팅(위아래)(20회)으로 반응을 철저히 혼합합니다.
   메모: 반응이 96웰 플레이트에 있는 경우, 기포 형성을 방지하기 위해 볼텍싱하는 대신 전체 부피를 20회 위아래로 피펫팅합니다.
3. 샘플을 간단히 원심 분리하여 혼합물을 튜브 바닥 또는 웰에 가라앉힙니다.
   메모: 반응이 액적 생성을 위해 실온에서 이루어져야 합니다. 각 카트리지의 여분/미사용 웰에 대해 ddPCR 믹스 1개를 준비합니다(각 카트리지에는 8개의 웰이 있음).

3. 액적 생성

1. 50μL 멀티채널 피펫을 사용하여 ddPCR 샘플 혼합물 20μL를 카트리지의 중간 줄에 로드합니다(그림 1A, 상단).
2. 70μL의 오일을 맨 아래 열에 로드합니다. 20μL의 1x ddPCR 슈퍼믹스를 사용하지 않는 웰에 로드합니다.
   메모: 거품을 도입하지 마십시오.
3. 중앙의 오목한 부분을 피하고 가장자리에만 닿도록 개스킷을 놓습니다(그림 1B).
4. 플레이트를 액적 생성기에 단단히 놓고 덮개를 닫아 실행을 시작합니다.
5. 멀티채널 피펫을 사용하여 카트리지의 맨 윗줄(그림 1A, 하단)에서 40μL의 에머젼 혼합물을 96웰 플레이트로 옮깁니다.
   1. 액체 샘플을 45-30° 각도로 3-5초 동안 그립니다. 혼합물을 우물 측면으로 3° 각도로 45초 이상 천천히 배출하여 측면 아래로 떨어지도록 합니다. 모든 액체를 배출하기 위해 피펫의 두 번째 정지 (완전 배출)로 이동하는 것은 괜찮습니다.
6. 호일 히트 씰을 사용하여 180°C에서 5초 동안 플레이트를 밀봉합니다.

4. PCR

1. 밀봉된 플레이트를 thermocycler(그림 1C)에 넣고 다음과 같이 NHEJ Drop-Off 지침에 따라 권장 PCR 조건을 설정합니다.
   1. 95°C에서 10분 동안 초기 변성
   2. 변성 40초 동안 94°C, 어닐링 55분 동안 1°C, 연장을 위해 60°C를 2분 동안 설정합니다.
   3. 98°C에서 10분 동안 유지합니다.
   4. 4 °C에서 유지 .
      메모: 특정 프라이머 및 프로브 세트에 대한 어닐링 온도는 열 구배를 사용하여 최적화할 수 있습니다. 모든 단계에 대해 2°C/s의 램프 속도를 사용합니다. PCR 조건은 각 실험 설계 및 설정에 따라 조정해야 합니다.

5. 물방울 판독

1. 왼쪽 상단에 A-1 웰이 있는 액적 판독기에 플레이트를 단단히 놓습니다(매끄럽게 처리된 모서리, 다른 세 개는 가장자리가 있음)(그림 1D).
2. 프로그램에서 플레이트를 설정합니다: FAM을 알려진 참조 채널로 지정하고 HEX를 알 수 없는 채널로 지정합니다(그림 2A).
3. Droplet 판독 실험을 직접 정량화로 실행합니다. 실행이 완료된 후 분석에 대한 실험 유형을 Drop-Off(DOF)로 변경합니다(그림 2A).

결과

그림 1: 실험 설정 및 절차. (A) 액적 생성을 위한 카트리지 준비. (맨 위) 샘플은 카트리지의 중간 줄에 채워지고 오일은 맨 아래 줄에 채워집니다. (아래) 액적 생성 후 유화된 액적으로 채워진 맨 위 줄. (B) 카트리지가 샘플로 채워지고 개스킷으로 덮인 액적 발생기. (C) Thermo-Cycler에서 호일 씰로 덮인 96웰 플레이트. (D) 96웰 플레이트가 있는 액적 리더와 플레이트를 고정하기 위해 플레이트 위에 걸쇠를 걸고 있는 금속 덮개.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
시약
프로브용 ddPCR Super Mix(dUTP 없음)	바이오 라드	1863024
EDTA (산도 8.0)	인비트로젠	AM9260G
PCR 등급 물			인증된 PCR 등급의 모든 물을 사용할 수 있습니다.
프로테라아제 K 20 mg/mL	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	AM2546
자료
ddPCR 96웰 플레이트	바이오 라드	12001925
액적 발생기 DG8 카트리지 및 개스킷	바이오 라드	1864007
프로브용 액적 생성 오일	바이오 라드	1863005
형광 프로브(예: FAM/HEX 프로브)	시그마-알드리치	해당 사항 없음	프로브는 실험에 따라 다르며 사용 가능한 모든 인증 판매자에서 구입할 수 있습니다.
정방향 및 역방향 올리고뉴클레오티드 프라이머	시그마-알드리치	해당 사항 없음	프라이머는 실험에 따라 다르며 사용 가능한 모든 인증 판매자로부터 구입할 수 있습니다.
설비
C1000 터치 열 순환기	바이오 라드	1851148	그라디언트 기능이 있는 다른 Thermo cycler와 깊은 우물을 사용할 수 있습니다

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