최적의 어닐링 온도를 결정하기 위한 그래디언트 중합효소 연쇄 반응

초록

출처: Tsujimoto, H. et al., Mosquito Aedes aegypti에서 고해상도 용융 분석을 사용하여 CRISPR/Cas9 돌연변이 유발 후 Indel 검출. J. Vis. 특급 (2021).

이 비디오는 웰을 따라 그래디언트 어닐링 온도를 설정하는 프라이머의 어닐링 온도 최적화를 위한 그래디언트 중합효소 연쇄 반응을 보여줍니다. 다양한 어닐링 온도의 효과는 반응 조건을 최적화하는 데 도움이 되는 증폭된 산물의 수율에 의해 결정됩니다.

프로토콜

1. 단일 뉴클레오티드 다형성(SNP), HRMA 프라이머 설계 및 프라이머 검증 스캔

1. 야생형 실험실 군집 모기에서 SNP 식별
   1. 적절한 폴리펩티드 번역을 방해할 타겟 엑손을 선택합니다.
      메모: 표적은 시작 코돈에 가깝거나 단백질 기능에 필요한 주요 잔류물 사이에 있어야 합니다. 엑손이 짧을수록(예: ≤200 염기) 표적화 및 분석이 더 어려워집니다. 엑손의 경계에 가까운 곳에서 편집하면 HRMA 프라이머 중 하나가 인트론을 교차하거나 인트론에 있게 되므로 편집하지 마십시오. 이는 해당 지역에서 SNP 비율이 훨씬 더 높은 경향이 있기 때문에 바람직하지 않습니다.
   2. 프라이머 디자인
      1. NCBI Blast - Primer Blast 웹사이트로 이동하여 선택한 엑손을 복사하여 페이지 상단의 상자에 붙여넣습니다. | PCR 산물 크기를 선택합니다(대부분의 엑손을 포함해야 함) | 유기체를 선택합니다.
      2. Advanced parameters(고급 매개변수)를 클릭합니다. Opt(PCR Product Tm의 경우) 및 60 추가(최적 온도 60 °C) | 입문서를 받으세요. 다른 매개변수는 기본값으로 유지합니다.
   3. 야생형 실험실 군체에서 게놈 DNA(gDNA)를 얻습니다. 모기 10마리를 따로 치워두고 CO₂로 마취한 다음 얼음 위의 페트리 접시에 넣어 비활성 상태로 유지합니다. 조직에서 DNA를 방출하기 위한 0.5 μL의 시약과 20 μL의 희석 완충액을 포함하는 10개의 튜브를 설정하며, 둘 다 재료 표에 제시된 DNA 방출 키트에 제공됩니다.
   4. 집게를 사용하여 단일 모기에서 한쪽 다리를 제거하고 DNA 방출 시약의 희석 용액 (1.1.3 단계에서)의 해당 튜브에 넣고 다리를 용액에 완전히 담그십시오. 나머지 모기에 대해 이 단계를 반복하고 다음 단계로 진행하기 전에 70% 에탄올로 집게를 닦습니다.
   5. 다리 함유 용액을 실온에서 2-5분 동안 배양한 다음 98°C에서 2분 동안 배양하고 PCR 반응을 설정하는 동안 냉각시킵니다.
      메모: 방출된 gDNA를 포함하는 플레이트는 -20°C에서 보관할 수 있으며 이 시점에서 프로토콜을 일시 중지할 수 있습니다.
   6. 10 μL의 2x PCR Master Mix, 0.5 μM의 최종 농도의 프라이머, 20 μL의 최종 부피의 분자 등급 물을 포함하는 10개의 튜브를 준비하고 1 μL의 희석된 샘플을 각 튜브로 옮깁니다. 다음 사이클링 매개 변수에 따라 PCR을 수행하십시오 : 98 ° C 5 분, 5 초 동안 98 ° C의 40 사이클, 60 ° C 30 초, 72 ° C kb 당 20 초; 72°C에서 1분 동안 최종 연장.
   7. 효소로 PCR 산물을 정제하여 잔류 PCR 프라이머를 분해하고 과량의 dNTP 또는 컬럼 클린업 키트를 탈인산화합니다. 샘플 염기서열분석을 진행합니다.
   8. 이중 피크/모호한 염기의 존재에 대해 각 전기표도를 분석하고 적절한 퇴화 염기 코드를 사용하여 각 시퀀스에서 염기 호출을 수동으로 조정합니다.
      메모: 이 단계는 염기 호출 소프트웨어가 더 눈에 띄는 피크를 "true" 염기 호출로 선택하여 SNP가 없다는 잘못된 인상을 주는 것이 일반적이므로 다중 염기서열 정렬 전에 수행해야 합니다.
   9. 재료 표에 나열된 정렬 소프트웨어인 SeqMan Pro 또는 ClustalW 또는 T-Coffe와 같은 기타 오픈 소스 정렬 소프트웨어를 사용하여 다중 시퀀스 정렬을 수행합니다.
      1. 정렬 소프트웨어를 열고 | Add Sequences(시퀀스 추가)를 클릭하고 원하는 시퀀스를 선택하고 Add(추가)를 클릭합니다. 모든 시퀀스가 선택되면 Done(완료)을 클릭합니다.
      2. Assemble을 클릭하여 정렬을 수행합니다. 정렬을 열려면 Contig 1을 클릭하고 정렬을 분석하고 SNP를 식별합니다(그림 1).
         메모: 단계 1.1.3-1.1.6의 대안으로, PCR은 벌크 샘플(>10명의 개체에서 파생)에서 얻은 분리된 게놈 DNA에서 수행할 수 있습니다. 염기서열분석된 앰플리콘은 전기영체도에서 이중 피크로 나타나는 SNP의 존재 여부를 직접 분석할 수 있지만, 드문 SNP는 검출하기가 더 어렵습니다.
   10. 에 설명된 프로토콜에 따라 위에서 확인된 SNP를 포함하는 영역을 피하면서 3-5개의 단일 가이드 RNA(sgRNA)를 설계합니다.

2. HRMA 프라이머 디자인

1. mFold를 사용하여 PCR 중 2차 구조의 형성 가능성에 대한 엑손 염기서열을 테스트합니다.
   1. UNAFold 웹 서버로 이동하여 mFold를 클릭하고 드롭다운 메뉴에서 Applications(응용 프로그램) | DNA 접는 형태.
   2. 상자에 염기서열 이름을 입력하고 엑손을 붙여넣습니다.
   3. 접는 온도를 60 °C로 변경하고, 이온 조건에서 [Mg⁺⁺]를 1.5로 변경하고, 단위에서 mM으로 전환하고, DNA를 접는 것을 클릭합니다.
   4. 출력에서 구조 1 아래의 pdf를 클릭하여 원형 구조 플롯을 엽니다.
2. 프라이머 설계를 위해 NCBI Blast - Primer Blast로 이동합니다.
3. 1.1단계에서 염기서열분석을 통해 결정된 선택된 엑손 염기서열(SNP 수가 가장 적거나 SNP가 없는 염기서열)을 복사하여 페이지 상단의 상자에 붙여넣습니다.
4. 기호 < > 사용하여 SNP, 타겟 부위 및 2차 구조 형성 가능성이 있는 영역을 포함하는 시퀀스를 표시하고 제외합니다.
5. PCR 산물 크기를 80 - 150 bp 사이로 선택하고 organism.
   를 선택합니다. 메모: 더 큰 단편 크기를 성공적으로 사용할 수 있습니다(~300bp). 그러나 더 긴 앰플리콘은 하나 또는 몇 개의 염기쌍에서 다른 염기서열 간의 감도를 감소시킬 수 있습니다.
6. Get Primers를 클릭합니다. 테스트할 2-3쌍의 프라이머를 선택합니다(이상적으로는 프라이머 부위가 CRISPR 표적 부위에서 ≥20–50bp 떨어져 있어야 함).

3. 입문서 검증

1. 단일 개체의 gDNA를 사용하여 그래디언트 PCR을 수행합니다.
   1. 마스터 믹스를 준비하고 별도의 튜브에서 NTC(Non-Template Control)를 위한 샘플 하나를 제거합니다. 남은 마스터 믹스에 템플릿을 추가하고 96웰 플레이트에 부분 표본을 넣습니다.
   2. 사이클링 매개변수를 따르십시오: 98°C 30초, 98°C에서 10초 동안 34주기, 55–65°C 30초, 72°C 15초, 72°C에서 10분 동안 최종 연장.
   3. 변성 단계 95°C에서 1분, 60°C에서 1분간 어닐링, 75°C와 95°C 사이에서 0.2°C 단위로 용융 곡선 감지, 각 온도에서 10초의 유지 시간 매개변수에 따라 열 용융 프로파일을 생성합니다.
      메모: 단일 열 용융 프로파일이 있는 어닐링 온도만 사용해야 합니다.

결과

그림 1: SNP 식별. wild-type에서 AaeZIP11 단편의 다중 염기서열 정렬에 대한 개략도. 빨간색은 SNP이고 녹색은 SNP가 없는 단편입니다. 이 SNP가 없는 영역은 sgRNA 및 프라이머 설계에 제안됩니다. 약어: SNP = 단일 뉴클레오티드 다형성; sgRNA = 단일 가이드 RNA; LVP = 리버풀 변종.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
70% 에탄올			물에 있는 70% 에탄올 해결책
96-well PCR 및 Real-time PCR 플레이트	폭스바겐	82006-636	게놈 DNA를 얻기 위해 (모기 다리에서)
96웰 플레이트 템플릿			유전자형 기록을 위해 집에서 만든 인쇄
바이오 라드 CFX96	바이오 라드		그래디언트 및 HRMA 기능이 있는 PCR 기계
다양한 생명공학 시약 저장소	폭스바겐	제490006-896
Exo-CIP 신속 PCR 클린업 키트	뉴잉글랜드 바이오랩스	E1050에스
유리 페트리 접시	폭스바겐	89001-246	150mm x 20mm
Nunc 폴리올레핀 아크릴레이트 밀봉 테이프, Thermo Scientific	폭스바겐	37000-548	게놈 DNA를 얻기 위해 96-well PCR 플레이트와 함께 사용
Phire Animal tissue direct PCR 키트(샘플링 도구 제외)	써모 피셔	F140WH	게놈 DNA를 얻고 PCR 수행을 위해
정밀 용융 해석 소프트웨어	바이오 라드	1845025	모기 DNA 샘플의 유전형 분석 및 이중 가닥 DNA의 열 변성 특성을 분석하는 데 사용됩니다(프로토콜 단계 3.3 참조).
단일 채널 피펫터	길슨
Phire Animal tissue direct PCR 키트(샘플링 도구 제외)	써모 피셔	F140WH	게놈 DNA를 얻고 PCR 수행을 위해
시크맨 프로	DNAstar Lasergene 소프트웨어		다중 시퀀스 정렬의 경우
단일 채널 피펫터	길슨

년 호 년 〈화이트〉 〈화이트〉