이중 유전자 마커의 동시 정량을 위한 Duplex Digital PCR

Abstract

출처: Cao, Y., et al. Enterococcus spp.의 동시 정량화를 위한 이중 디지털 PCR 분석.및 물의 인간 배설물 관련 HF183 마커. J. Vis. 특급 (2016년)

이 비디오에서는 두 개의 서로 다른 유전자 마커를 동시에 검출하는 데 유용한 기존 PCR 기술을 변형한 ddPCR(duplex digital PCR) 기술을 보여줍니다. 단일 PCR 반응은 독립적으로 증폭되는 나노리터 크기의 유화 액적으로 분할되며, 액적 분획에서 서로 다른 색상의 형광 증폭 신호를 검출하는 것은 표적 염기서열의 초기 농도를 계산하는 데 사용됩니다.

Protocol

1. 분석 혼합물 준비

1. TE pH 8 완충액의 분자 등급 물 및 프로브의 모든 프라이머에 대해 100μmol/L 스톡 농도를 만듭니다[Entero F1A, Entero R1, GPL813TQ; HF183-1, BthetR1, BthetP].
   참고: 두 표적에 대한 프로브는 List of Materials/Equipment에 표시된 대로 서로 다른 형광단으로 형광 표지되어 있습니다.
2. 계획된 반응에 따라 12μl 디지털 PCR 혼합물(2x 스톡, 재료/장비 목록 참조), 각 정방향 및 역방향 프라이머 0.216μl, 각 형광 프로브 0.06μl 및 5.016μl 뉴클레아제가 없는 물(최종 농도: 각 프라이머 900nM, 각 프로브 250nM)을 혼합하여 마스터 믹스를 준비합니다. 피펫을 위아래로 최소 10회 이상 반복하여 혼합하면서 용액에 기포가 유입되지 않도록 주의하십시오.
3. 18 μl 마스터 믹스(단계 1.2)를 일반 PCR 튜브 또는 플레이트에 피펫팅하고 6 μl DNA 템플릿(앞에서 설명한 대로 추출)을 혼합하여 액적 생성을 위한 분석 혼합물을 만듭니다. 샘플을 중복으로 실행하는 경우 36μl의 마스터 믹스와 12μl DNA 템플릿을 각 웰에 피펫팅합니다. 해당 복제 웰을 플레이트에 비워 둡니다. 포지티브 대조군(재료/장비 목록 참조) 및 템플릿 대조군(NTC) 없음(즉, 분자 등급의 물이 형판으로 사용됨)을 포함합니다.
   메모: 양성 대조군은 분석이 제대로 실행되고 있는지 확인하는 데 필요하며, NTC는 플레이트 내에 오염이 없는지 확인하고 나중에 데이터 분석에서 형광 기준선을 설정하는 데 필요합니다. 처음 사용자는 희석되지 않은 DNA 샘플과 희석된 DNA 샘플을 모두 사용하는 것이 좋습니다.

2. 액적 생성 및 PCR 플레이트 설정

1. 멀티채널 피펫을 사용하여 약 15회 위아래로 피펫팅하여 분석 혼합물을 혼합합니다. 혼합물 내에 과도한 기포가 생기지 않도록 피펫 팁이 액체 내에 남아 있는지 확인하십시오.
2. 카트리지 1(8웰 포함)을 흰색 카트리지 홀더에 삽입하고 카트리지 홀더를 딸깍 소리를 내며 닫습니다. 이제 카트리지 1이 제자리에 단단히 고정되었으며 물방울을 생성하는 동안 홀더에서 분리할 수 없습니다. 멀티채널 피펫을 사용하여 기포 없이 20μl의 분석 혼합물을 'Sample'이라고 표시된 카트리지의 중간 위치로 부드럽게 옮깁니다.
3. 70μl의 액적 생성 오일을 카트리지 왼쪽에 피펫으로 넣습니다('오일'로 표시).
4. 개스킷으로 카트리지를 덮고 개스킷이 평평하고 카트리지 가장자리를 향해 4개의 눈금만큼 고르게 고정되도록 합니다. 액적 발생기의 녹색 불이 켜진 버튼을 눌러 카트리지를 열고 놓습니다. 녹색이 켜진 버튼을 다시 눌러 발전기를 닫습니다.
   메모: 문이 닫히면 버튼이 어두워지고 문을 다시 열 수 없으며 즉시 비말 생성이 시작되어 약 1분 동안 계속됩니다.
5. 8회 이상 반응하는 경우 카트리지 2를 두 번째 흰색 카트리지 홀더에 놓고 액적 생성이 진행되는 동안 카트리지 1과 동일한 방식으로 준비하여 총 설정 시간을 절약합니다.
6. 희미한 조명이 켜진 버튼이 녹색으로 바뀌면 액적 생성이 완료되었음을 나타내는 액적 생성기 도어를 엽니다. 카트리지 1이 들어 있는 흰색 카트리지 홀더를 제거하여 따로 보관하고 카트리지 2를 액적 발생기에 놓습니다.
7. 카트리지 1에서 개스킷을 제거하고 폐기합니다. 카트리지의 세 번째 컬럼('액적'으로 표시)에서 생성된 액적의 총 부피(약 40μl)를 열 순환을 위해 최종 PCR 플레이트(실온에서 유지됨)로 부드럽게 옮깁니다.
   메모: 흰색 카트리지 홀더를 클릭 해제하면 새로 생성된 물방울이 깨질 수 있습니다. 방울이 최종 플레이트로 옮겨진 후에만 카트리지 홀더를 엽니다.
8. 추가 샘플에 대해 2.1-2.7단계를 반복합니다.
9. 모든 액적이 최종 PCR 플레이트에 있으면 플레이트 위에 관통 가능한 호일 덮개를 놓고 플레이트 밀봉기에 놓습니다. 실러를 180°C로 설정하고 실러에서 '재생'을 누른 후 10초 동안 밀봉합니다.

3. 열 순환 및 액적 판독

1. 2.7단계에서 사용된 최종 PCR 플레이트와 호환되는 밀봉된 플레이트를 2.0°C/sec의 온도 램핑 속도로 열 순환기에 놓습니다.
2. 95°C에서 10분, 94°C에서 30초, 60°C에서 60초씩 40회 사이클, 98°C에서 10분 유지(옵션: 4 또는 15°C에서 최종 유지)와 같이 열 프로그램을 실행합니다.
3. 사이클링이 완료되면 플레이트를 Droplet Reader로 옮겨 각 웰의 각 액적에서 형광을 자동으로 측정합니다. 또는 액적을 판독하기 전에 최대 4일 동안 플레이트를 3°C에서 보관하십시오. 읽기를 진행하기 전에 물방울이 실온에 있는지 확인하십시오.
   1. 함께 제공되는 소프트웨어를 열어 액적 판독을 설정합니다. 빈 96웰 플레이트의 회로도가 포함된 기본 '설정' 메뉴에서 웰 A1을 두 번 클릭하여 'Sample', 'Assay 1' 및 'Assay 2'의 세 섹션이 포함된 메뉴를 엽니다.
   2. 'Sample' 섹션에서 'Name'이라고 표시된 상자에 샘플 ID를 입력하고 Enter 키를 누르거나 오른쪽에 있는 'Apply'라고 표시된 상자를 선택합니다. 그런 다음 'Experiment'라고 표시된 드롭다운 메뉴를 클릭하고 'RED'(희귀 이벤트 감지)를 선택한 다음 enter를 클릭합니다.
   3. 'Assay 1'로 표시된 섹션으로 이동합니다. 'Name' 섹션에서 분석(예: Enterococcus)을 입력하고 Enterococcus를 클릭합니다. 아래 '유형'이라고 표시된 상자에서 드롭다운 메뉴를 클릭하고 '채널 1 알 수 없음'을 선택한 다음 Enter를 클릭합니다.
   4. 'Assay 2'로 표시된 섹션으로 이동합니다. 'Name' 섹션에서 Assay(예: HF183)를 입력하고 Enter를 클릭합니다. 아래 '유형'이라고 표시된 상자에서 드롭다운 메뉴를 클릭하고 '채널 2 알 수 없음'을 선택한 다음 Enter를 클릭합니다. 3.3.2단계에서 3.3.4까지의 모든 정보는 이제 A1 웰에 있습니다.
   5. 액적을 포함하는 모든 후속 웰의 이름을 지정합니다. 총 설정 시간을 절약하려면 'Shift' 또는 'Ctrl'을 클릭하여 여러 웰을 동시에 선택합니다.
   6. 플레이트의 디지털 묘사가 실제 플레이트를 미러링하면 메뉴 오른쪽 하단의 '확인'을 누릅니다. 플레이트 설계도 상단에 나타나는 새 메뉴의 '템플릿' 섹션에서 '다른 이름으로 저장'을 선택하고 플레이트의 이름을 지정하고 저장합니다.
   7. 화면 왼쪽의 '실행'을 클릭하고 팝업 "실행 옵션" 창에서 적절한 염료 세트를 선택합니다. 데이터 수집이 시작되고 소프트웨어에 실시간으로 표시됩니다.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Low Bind 마이크로튜브	코스타	3207	시약 보관, 시료/마스터 믹스 생산용
뉴클레아제가 없는 물	피셔사이	BP2484-50
TE pH 8 완충액	피셔사이	BP2473-100
하드쉘 96웰 플레이트	바이오라드	HSP-9601	초기 마스터 믹스 및 시료 접종용
알루미늄 씰링 필름	바이오라드	Tel.: 359-0133	샘플 플레이트를 밀봉하기 위해
액적 생성기	바이오라드	제186-3002
액적 생성 오일	바이오라드	제186-3005
카트리지	바이오라드	제186-4008
DG8 카트리지 홀더	바이오라드	제186-3051
개스켓	바이오라드	제186-3009
20uL 피펫 팁	라이닌	GP-L10F	카트리지로 샘플/마스터 믹스를 탠퍼링하기 위해
200uL 피펫 팁	라이닌	GP-L200F	액적을 최종 Twin.Tec 플레이트로 이송하기 위해
Twin.Tec 96웰 플레이트	에펜도르프	951020320	최종 액적, 열 순환 및 판독을 위해
피어싱 가능한 히트 씰 호일	바이오라드	제181-4040	열 사이클링 전에 Twin.Tec 플레이트를 밀봉하기 위해
PX1 PCR 플레이트 씰러	바이오라드	181-4000	열 순환기만 필요하며 광학 장치는 필요하지 않습니다
CFX96 열 순환기	바이오라드	CFX96 및 C1000
QX100 액적 판독기	바이오라드	제186-3001
액적 리더 오일	바이오라드	제186-3004
액적 PCR 슈퍼믹스	바이오라드	제186-3024	즉, 원고의 디지털 PCR 믹스
QuantaSoft 소프트웨어(v1.3.2)	퀀타소프트	큐엑스100	ddPCR 데이터 보기, 분석 및 내보내기용
엔테로 포워드 프라이머 (Ent F1A)	오페론	가아	대체 공급 업체를 사용할 수 있습니다.
엔테로 리버스 프라이머 (Ent R1)	오페론	CAGTGCTCTACCTCCATCATT	대체 공급 업체를 사용할 수 있습니다.
엔테로 프로브 (GPL813TQ)	오페론	[6-FAM]-TGG TTC TCT CCG AAA 태그 CTT 태그 GGC TA-[BHQ1]	대체 공급업체를 사용할 수 있지만 형광단은 FAM이어야 합니다.
HF183 앞으로 뇌관 (HF183-1)	오페론	ATCATGAGTTCACATGTCCG	대체 공급 업체를 사용할 수 있습니다.
HF183 리버스 프라이머(BthetR1)	오페론	CGTAG가트트가크트가크트gtgt	대체 공급 업체를 사용할 수 있습니다.
HF183 프로브(BthetP1)	오페론	[6-HEX]-CTGAGAGGAAGGTCCCCC ACATTGGA-[BHQ1]	대체 공급업체를 사용할 수 있지만 형광단은 HEX여야 합니다(VIC를 사용하는 경우 적절한 매트릭스 보상을 선택해야 함).
포지티브 컨트롤			E.faecalis 게놈 DNA와 HF183 표준 플라스미드의 혼합물(IDT에서 주문). E. faecalis를 배양하는 자세한 방법과 주문한 HF183 플라스미드의 염기서열은 Cao et al. 2015 (doi:10.1016/j.watres.2014.12.008)를 참조하십시오. 시판되는 Enterococcus DNA 표준물질(ATCC 29212Q-FZ)은 실험실에서 준비한 E. faecalis 게놈 DNA 대신 양성 대조군에 사용할 수도 있습니다.