바이러스 감염 진단을 위한 Real-Time Quantitative Reverse Transcription PCR

초록

출처: Marston, D. A. et al. 광견병 진단을 위한 Pan-lyssavirus 실시간 RT-PCR. J. Vis. 특급 (2019).

이 비디오는 실시간 역전사 PCR을 사용하여 바이러스 감염을 감지하는 정량적 방법을 보여줍니다. 역전사 단계는 RNA를 cDNA로 변환한 다음 PCR 주기를 통해 증폭합니다. 샘플에 바이러스 RNA가 존재한다는 것은 PCR에서 얻은 DNA의 증폭 및 해리 곡선을 분석하여 확인합니다.

프로토콜

1. 마이크로 볼륨 분광 광도계를 사용한 RNA 정량화

1. 분광 광도계의 설정이 RNA로 설정되어 있는지 확인하십시오.
2. 1-2μL의 분자 등급 물을 사용하여 기계를 초기화하고 기준선을 설정합니다.
3. 각 테스트 RNA 샘플 1-2 μL를 사용하여 RNA 수량을 평가합니다.
4. 판독 값과 문서를 저장하십시오.
5. 필요한 경우 RNA를 1μg/μL로 조정합니다.
   메모: RNA는 항상 얼음 위에(또는 시원한 블록에) 보관해야 합니다. 컬럼 또는 비드 기반 방법을 사용하여 RNA를 얻는 경우 RNA는 일반적으로 1μg/μL 미만입니다. 이 상황에서는 RNA를 깔끔하게 사용하십시오.

2. 종말점 감도를 결정하기 위한 RNA 희석 시리즈 준비

1. RNA를 10배 연속 희석합니다.
   1. dilution series(예: ^10-1, ^10-2 등)와 RNA 세부 정보가 포함된 튜브에 라벨을 붙입니다.
   2. 각 튜브에 45μL의 분자 등급 물을 추가합니다.
   3. RNA 5μL(이전에는 1μg/μL로 희석)를 넣고 잘 섞습니다.
   4. 피펫 팁을 적절한 소독제에 버리고 새 팁으로 교체하십시오.
   5. ^10-1에서 5μL를 취하고 ^10-2 튜브에 넣고 잘 섞습니다.
   6. 나머지 희석액으로 2.1.3-2.1.5를 반복합니다.
      참고: RNA는 항상 얼음 위에(또는 시원한 블록에) 보관해야 합니다.

3. Real-time RT-PCR 반응 준비

1. 스프레드시트를 사용하여 lyssavirus 및 ß-actin assay.
   모두에 대한 테스트 샘플 및 대조 샘플의 수에 따라 플레이트 레이아웃을 계획합니다. 메모: 4개의 샘플을 positive 및 negative control로 이중으로 테스트해야 하는 경우 두 분석 모두에 대해 10개의 반응과 같습니다.
2. RNA 템플릿과 분리된 '클린룸' 또는 영역에서 사용하기 전에 적절한 소독제로 표면을 닦아내거나 PCR 워크스테이션(사용하는 경우)을 준비합니다. 워크스테이션을 준비하려면 적절한 소독제로 캐비닛 표면을 닦고 필요한 품목을 워크스테이션에 넣고 도어를 닫습니다. 자외선을 10분 동안 켭니다.
3. 냉동고에서 리젠트와 프라이머를 제거하고 해동합니다(표 1에 나열된 시약과 표 2에 나열된 프라이머).
   알림: 효소 혼합물은 글리세롤에 저장되므로 해동이 필요하지 않으며 항상 얼음(또는 시원한 블록)에 보관해야 합니다. 다른 모든 시약은 실온에서 해동할 수 있습니다.
4. 해동되면 시약과 원심분리기를 잠시 혼합하여 액체를 수집합니다.
   알림: 효소 혼합물을 와류로 만들지 말고 간단히 원심분리하십시오.
5. lyssavirus 및 ß-actin에 대한 별도의 마스터 믹스를 준비합니다. 각 반응에 대해 분자 등급 정제수 7.55μL, 2x 범용 SYBR 녹색 반응 혼합물 10μL, 순방향 프라이머 0.6μL, 역방향 프라이머 0.6μL, iTaq RT 효소 혼합물 0.25μL를 추가합니다.
   1. 스프레드시트를 사용하여 올바른 부피를 계산하면 수동 계산 오류를 방지할 수 있습니다. 파이펫팅 오류를 보상할 수 있도록 충분한 마스터 믹스가 준비되었는지 확인하십시오. 따라서 10회의 반응이 필요한 경우(3.1의 참고 참조) 12회의 반응을 준비합니다
   2. 마스터 믹스를 얼음 위에(또는 시원한 블록에) 준비하고 실시간 기계에 넣을 때까지 얼음 위에 남아 있습니다.
6. 준비된 마스터 믹스를 혼합하고 간단히 원심분리한 다음 19μL를 스트립 튜브의 해당 웰 또는 사용 중인 실시간 기계와 호환되는 96웰 플레이트에 분배합니다.
   참고: 피펫팅하는 동안 웰에서 기포 생성을 최소화하십시오.
7. 별도의 방 또는 3.2에 설명된 대로 준비된 UV 캐비닛에서 이전에 1μg/μL로 조정된 RNA 1μL(단계 1.5 참조)를 적절한 마스터 믹스 웰의 표면 아래에 조심스럽게 추가하고 부드럽게 혼합합니다. 사용 직후(표면 아래) 피펫 팁을 소독제에 버리십시오.
   1. 테스트 샘플 뒤에 대조군을 추가하고, 양성 대조군이 다음에 추가되고 템플릿 없음 대조군(NTC – 분자 등급 물)이 마지막에 추가됩니다. 사용되는 RNA의 양은 샘플 유형 및 사용된 RNA 추출에 따라 변경될 수 있습니다. 반응이 최적화되었는지 확인하기 위해 사용된 양을 검증해야 합니다.
8. 스트립 뚜껑 또는 밀봉기를 사용하여 플레이트를 밀봉하고 모든 뚜껑이 단단히 닫히고 샘플의 방향을 잡을 수 있을 만큼 충분히 레이블이 지정되었는지 확인합니다. 플레이트/스트립 튜브의 가장자리에 레이블을 지정합니다.
9. 원심분리기를 사용하여 샘플을 회전시켜 웰 바닥에 있는 모든 액체를 수집합니다.
10. 플레이트를 Real-Time PCR 기계로 옮기고 도어를 연 다음 플레이트 레이아웃에 따라 샘플의 올바른 위치/방향을 확인하는 홀더에 넣습니다.
    알림: 튜브 스트립을 사용하는 경우 홀더가 제자리에 있는지 확인하십시오.
11. real-time PCR 기계 프로그램을 열고 해리 곡선을 사용한 SYBR 실시간 실험 옵션을 선택합니다. 데이터 수집 지점을 포함하여 표 3에 지정된 열 순환 조건을 사용하여 Real-Time PCR 기계를 프로그래밍합니다.
12. 형광 염료로 SYBR을 선택하고 샘플 유형으로 unknown을 선택한 다음 올바른 샘플 이름 상자에 이름을 삽입합니다.
    메모: 복제물과 lyssavirus와 ß-actin 웰을 구별합니다.
13. 실험 데이터를 저장할 파일 위치를 선택하고, 실행이 끝나면 램프가 꺼지는지 확인한 다음 실행을 시작합니다.
    알림: 첫 번째 단계는 RT이므로 s로tage, 이 시간 동안 데이터가 수집되지 않으므로 lamp 예열 시간이 필요한 경우 RT 단계에서 발생할 수 있습니다. 실시간 기계와 소프트웨어는 증폭 곡선을 실시간으로 표시하고, 용융 곡선은 사이클이 끝날 때 생성됩니다.

결과

표 1: Pan-lyssavirus real-time RT-PCR 마스터 믹스 시약.

분 분 호 ...

시약	μL/반응
분자 등급의 물	7.55
2x 범용 RT PCR 반응 혼합물	10
프라이머 포워드 [20 μM]	0.6
프라이머 리버스 [20 μM]	0.6
RT 효소 믹스	0.25

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Art Barrier 피펫 팁(다양한 크기)	써모피셔	다양한
원심 분리기	베크만	알레그라 21R	96개의 웰 플레이트를 수용할 수 있는 로터가 필요합니다. 3.8 단계.
원심분리기(마이크로)	시그마
Finnpipettes(0.5-1000 μL 분주용)	써모피셔	다양한
iTaq Universal SYBR Green 원스텝 RT-PCR 키트	바이오 라드	제172-5150	검증된 경우 동등한 키트를 사용할 수 있습니다.
MX3000P 또는 MX3005P Real-Time PCR 시스템	스트라타젠	해당 사항 없음	검증된 경우 동등한 기계를 사용할 수 있습니다
MicroAmp 반응 플레이트베이스	모든 적합한		튜브 스트립과 플레이트를 단단히 고정하는 데 사용됩니다.
광학적으로 투명한 플랫 클리어 스트립 (8)	ABgene	AB-0866
완벽한 핏 프레임(튜브 스트립을 사용하는 경우)	스트라타젠	해당 사항 없음	기계에만 해당됩니다.
프라이머: 프라이머 세부 사항은 표 2를 참조하십시오.			0.05μmole 규모의 HPLC 정제로 주문했습니다.
Thermo-Fast 96웰 플레이트, 비스킷	ABgene	AB-600
Thermo-Fast 스트립 (8) 써모튜브	ABgene	AB-0452
소용돌이 기계 / 월리 믹서	Fisons Scientific 장비	SGP-202-010J
명시되지 않는 한 대체 장비를 사용할 수 있습니다

호 . 시리즈