저주파 체세포 돌연변이를 검출하기 위한 Wild-type Blocking PCR

초록

출처: Albitar, A. Z. et al., 저주파 체세포 돌연변이 검출을 위한 고감도 방법으로 직접 염기서열분석과 결합된 야생형 차단 PCR. J. Vis. 특급 (2017).

이 비디오는 체세포 돌연변이를 감지하는 야생형 차단 중합효소 연쇄 반응(WTB-PCR)에 대해 설명합니다. PCR 기반 기술은 고정 핵산(locked nucleic acid, LNA)을 사용하는데, 이는 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide)로서 상보적인 야생형 대립유전자에 결합하고 그 신장을 차단합니다. 차단은 선택적으로 샘플의 야생형 변이체에 대한 저수준 돌연변이 대립유전자의 증폭을 허용합니다.

프로토콜

1. FFPE 조직, 말초 혈액 및 골수 흡인에서 DNA 추출

1. DNA FFPE 추출 키트가 있는 골수 FFPE 조직용
   1. 염색되지 않은 슬라이드(5 - 10μm 두께에서 5 - 10개 절편)의 FFPE 조직으로 시작합니다.
      메모: 조직 부스러기로 시작하는 경우 5 - 10 μm 두께의 3 - 6 섹션을 사용하고 1.1.6 단계로 건너뜁니다.
   2. 슬라이드 바구니에 슬라이드를 넣고 4개의 세척 저장통(자일렌용 2개, 100% 알코올용 2개)을 준비합니다. 각 바스켓에 최소 600mL의 용액을 추가합니다.
   3. 첫 번째 트레이에서 5분 자일렌 세척을 수행하여 슬라이드를 분리하십시오. 슬라이드를 두 번째 자일렌 세척 탱크로 5분 더 옮깁니다.
   4. 파라핀화 후 100% 알코올로 슬라이드를 5분 동안 세척하고 슬라이드를 두 번째 알코올 세척 탱크로 5분 더 옮깁니다.
   5. 면도날로 마이크로 원심분리기 튜브에 긁어넣기 전에 후드 아래에서 슬라이드를 완전히 건조시키십시오.
      메모: 종양 부위가 표시된 H&E 슬라이드를 사용할 수 있는 경우, 슬라이드를 정렬하고 종양 부위만 긁어냅니다.
   6. 키트에 포함된 제조업체 유인물의 지침에 따라 진행합니다.
2. BM 흡인 및 말초 혈액용
   1. 제조업체의 지침에 따라 다음 사양과 함께 추출합니다.
      메모: FFPE 조직 및 세포에서 DNA를 추출하기 위한 수많은 상용 키트 및 방법이 있습니다. 실질적으로 모두 사용할 수 있습니다. 실험실에서 확립된 방법을 사용하십시오.
      1. 200μL 말초 혈액(PB) 또는 100μL BM + 100μL PBS를 사용합니다.
      2. 4 μL RNase A 원액을 사용합니다.
      3. 100 μL 용리 완충액으로 용리합니다.
3. DNA 정량화
   1. 분광 광도계를 사용하여 약 1.8(순수 DNA의 경우)의 260nm/280nm 비율을 측정합니다. 비율이 눈에 띄게 낮으면 단백질, 페놀 또는 기타 오염 물질이 존재하여 다운스트림 응용 분야를 방해할 수 있음을 나타낼 수 있습니다.
   2. 적절한 용리 완충액을 사용하여 DNA 농도를 약 50 - 100 ng/μL로 조정합니다.

2. 야생형 차단 PCR

1. 프라이머 디자인
   1. PCR 프라이머 설계의 이전에 기술된 일반 지침에 따라 관심 유전자에 대한 프라이머를 설계하고 획득합니다. PCR 프라이머에 M13-forward 및 reverse universal sequencing 프라이머를 포함합니다.
      메모: MYD88 분석은 MYD88(G259 - N291)의 엑손 5와 5' 인트론 영역에 위치한 110개의 뉴클레오티드를 증폭하여 스플라이스 부위와 인트론 4의 일부를 덮도록 개발되었습니다. 정방향 및 역방향 프라이머는 5'-M13 시퀀스(M13- 순방향: tgt aaa acg acg gcc agt; M13-reverse: cag gaa aca gct, atg acc)를 사용하여 상보적 염기서열분석 프라이머의 어닐링을 허용합니다(재료 표 참조).
2. Locked Nucleic Acid 올리고뉴클레오티드 설계
   1. 블로킹 올리고뉴클레오티드를 약 10 - 15 염기 길이로 설계하고 돌연변이 농축이 필요한 WT 템플릿과 상보적입니다.
      메모: 더 짧은 올리고는 불일치 차별을 개선합니다. 높은 표적 특이성을 달성하려면 블로킹 뉴클레오티드를 너무 많이 사용하지 않는 것이 중요한데, 이는 매우 "끈적한" 올리고뉴클레오티드를 초래할 수 있기 때문입니다. 함량과 길이 및 차단 뉴클레오티드는 차단해야 하는 특정 뉴클레오티드에 따라 최적화되어야 합니다. 2차 구조를 손상시키지 않고 자기 상보성을 위험에 빠뜨리지 않고 높은 결합 특이성을 달성하는 것이 중요합니다.
   2. 블로킹 올리고가 열순환 중 확장 온도보다 10 - 15 °C 높도록 설계합니다. 블로킹 염기를 추가 또는 제거하거나 블로킹 G 또는 C 염기의 긴 스트레치(3 - 4 염기)를 피하면서 DNA를 블로킹 염기로 대체하여_Tm을 조정합니다.
      1. Oligo 도구 웹 사이트(재료 표 참조)로 이동하여 "Oligo T_m 예측 차단" 도구를 선택합니다.
      2. 차단하려는 WT 템플릿의 시퀀스를 "Oligo Sequence" 상자에 붙여넣습니다. 베이스 앞에 "+"를 추가하여 블로커 베이스를 나타냅니다.
      3. "계산" 버튼을 선택하여 DNA-Blocker 하이브리드의 대략적인_Tm을 결정합니다.
   3. 2차 구조 형성 또는 자체 이량체를 피하기 위해 블로킹 올리고를 설계합니다.
      1. Oligo 도구 웹 사이트(재료 표 참조)로 이동하여 "Oligo Optimizer 차단" 도구를 선택합니다.
      2. 차단하려는 WT 템플릿의 순서를 상자에 붙여넣습니다. 베이스 앞에 "+"를 추가하여 블로킹 베이스를 나타냅니다.
      3. "Secondary Structure" 및 "Self Only"에 대한 두 상자를 선택합니다. Analyze(분석) 버튼을 눌러 잠재적으로 문제가 될 수 있는 2차 구조 또는 자체 이합체에 대해 올리고를 검토합니다.
         메모: 점수는 2차 구조와 자체 이합체의_T-m에 대한 매우 대략적인 추정치를 나타냅니다. 따라서 낮은 점수는 최적이며 블로커-블로커 페어링을 제한하여 달성할 수 있습니다. MYD88 [MYD88 차단제(TCAGA+AG+C+G+A+C+T+G+A+T+CC/invdT/)]에 대한 차단 올리고뉴클레오타이드는 아미노산 Q262-I266을 커버하도록 설계되었으며 DNA 중합효소에 의한 확장과 3'-엑소뉴클레아제에 의한 분해를 모두 억제하는 3' 반전 dT를 특징으로 합니다. 이 특정 블로킹 올리고는 "+N"으로 표시되는 10개의 블로킹 베이스가 있는 17메르입니다. 나머지 7개 염기는 일반 DNA 뉴클레오티드입니다.
3. WTB-PCR 설정 및 열순환
   1. 2.5 μL PCR 반응 완충액 10x w/ 20 mM MgCl₂, 250 μM dNTP, 0.2 μM 정방향 및 역방향 프라이머, 1.2 μM MYD88 차단제 및 DNAse, RNAse-free, 초순수 H₂O를 사용하여 WTB-PCR 마스터 믹스(MMX)를 준비하여 반응당 21.75 μL의 최종 용액 부피를 생성합니다.
      메모: 작업 농도는 25 μL의 최종 반응 부피에 대한 것입니다(DNA 템플릿 및 중합효소 첨가 후). 종래의 PCR MMX는 차단제의 첨가를 생략하는 것만으로 제조된다. 모든 프로토콜 단계는 WTB와 기존 PCR 모두에 대해 동일하게 유지됩니다. 이는 유효성 검사에 사용할 수 있으며 차단제의 추가로 달성된 강화를 결정할 수 있습니다.
      1. 준비할 MMX의 양을 계산할 때 3개의 추가 반응(positive 및 negative control과 오염 확인을 위한 non-template control)과 파이펫팅 오류에 대한 최소 1개의 추가 반응을 고려해야 합니다.
   2. MMX를 철저하게 소용돌이치십시오. MMX는 -80°C에서 최대 1년 동안 보관할 수 있습니다.
   3. 반응당 0.25 μL Taq DNA 중합효소를 MMX에 첨가하고 혼합하도록 반전시킵니다. 중합효소가 MMX에 추가되면 얼음 위에 보관하십시오.
   4. 새로운 96-well PCR 플레이트를 냉각판에 놓고 22μL의 MMX를 각 반응 웰에 중합효소와 함께 피펫팅합니다.
   5. 3 μL 게놈 DNA(50 - 100 ng/μL)를 중합효소와 함께 MMX를 포함하는 각 웰에 추가합니다.
   6. 플레이트와 원심분리기를 짧게 밀봉하여 용액이 각 웰의 바닥에 도달하도록 합니다.
   7. PCR 플레이트를 열순환기에 로드합니다.
      1. WTB-PCR 반응에 대한 열순환 조건을 다음과 같이 설정하십시오 : 95 ° C에서 6 분 동안 초기 변성; 95 ° C에서 30 초 동안 변성 40 사이클, 56 ° C에서 30 초 동안 프라이머 어닐링, 72 ° C에서 1 분 20 초 동안 연장; 72 ° C에서 10 분 동안 최종 확장.
         메모: 모범 사례는 향후 설정에서 앰플리콘 오염을 방지하기 위해 물리적으로 분리된 영역에서 프로토콜의 나머지 부분을 완료하는 것입니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
1.5 또는 2 mL Safe-Lock 마이크로 원심분리기 튜브	에펜도르프	05-402-25
알코올 100%	폭스바겐	89370-084	조직학 급료; 91.5% 에탄올, 5% 이소프로필 알콜, 4.5% 메틸 알콜
알루미늄 씰링 포일	진메이트	T-2451-1	PCR 및 냉장 보관용
원심분리기 5804 시리즈	에펜도르프		A-2-DWP 로터(PCR 플레이트용)
96웰 플레이트용 냉각판	에펜도르프	Z606634
DNAse, RNAse-free, 초순수
dNTP(100mM)	인비트로젠	10297-117
에탄올 앱솔루트	시그마	E7023	200 proof, 분자 생물학용
Exiqon 웹 사이트 Oligo 도구			http://www.exiqon.com/oligo-tools
FastStart Taq DNA 중합효소 (5 U/μL)	로슈	12032937001	With10x 농축 PCR 반응 버퍼, 20mM MgCl2
겔 전기영동 장치			2% 아가로스 젤
LNA 올리고뉴클레오티드	엑시콘	500100	5'-TCAGA+AG+C+G+A+C+T+G+A +T+CC/invdT/ (+N = LNA 염기)
Mastercycler Pro S 써모사이클러	에펜도르프	E950030020
마이크로 원심분리기 Model 5430	에펜도르프		FA-45-30-11 로터(1.5/2 mL 마이크로 원심분리기 튜브용)
NanoDrop 2000 분광 광도계	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific
PCR 포워드 프라이머	증권 시세		5'-TGT AAA ACG ACG GCC AGT TGC CAG GGG TAC TTA GAT GG
PCR 리버스 프라이머	증권 시세		5'-cag gaa aca gct, atg, acc, GGT, TGG, TGT, AGT, CGC, AGA, CA
PCR 플레이트	진메이트	T-3107-1
피펫터			20, 200, 1,000 μL
QIAamp DNA 미니 키트	키아겐	51304	BM 흡인 및 말초 혈액용
소용돌이 지니	과학 산업	시-0236
슬라이드 바구니