박테리오파지를 열거하기 위한 정량적 중합효소 연쇄 반응(Quantitative Polymerase Chain Reaction to Enumerate Bacteriophage)

초록

출처: Peng, X., et al., Biopanning에서 T7 박테리오파지의 정량적 PCR. J. Vis. 특급. (2018년)

이 비디오에서는 DNA 정량화를 통해 T7 박테리오파지를 열거하기 위한 정량적 중합효소 연쇄 반응(qPCR)에 대해 설명합니다. PCR 혼합물의 형광 염료는 새로 합성된 DNA 가닥과 결합하여 형광을 방출하며, 이는 측정됩니다.

프로토콜

1. qPCR 반응 준비

참고: 하나의 PCR 반응은 하나의 샘플에 대한 것입니다. 각 PCR 반응에는 5μL의 qPCR 마스터 믹스(재료 참조), 1μL의 5μM 프라이머 쌍 믹스, 2μL의 H₂O 및 2μL의 열처리된 T7 파지 샘플이 포함됩니다. 다중 PCR 반응의 경우, 파지 샘플을 제외한 모든 시약이 하나의 1.5 mL 튜브에 사전 혼합됩니다. 프리믹스에 포함된 각 시약의 부피는 qPCR에 대한 파지 샘플의 수에 따라 다릅니다.

1. 농도를 알 수 없는 10개의 바이오패닝 파지 샘플과 표준 농도의 7개 샘플에 대한 qPCR 프리믹스를 3회 준비합니다. 그 결과, 총 51개의 샘플이 있으므로 51개의 qPCR 반응(즉, 샘플당 1개의 반응)이 있습니다. 51회 반응의 경우 qPCR 마스터 믹스 255μL(51x 5μL), 프라이머 51μL(51x 1μL) 및 H₂O 102μL(51x 2μL)의 프리믹스를 준비합니다.
   메모: PCR 혼합물을 96웰 qPCR 플레이트의 각 웰로 분주하는 동안 부피 손실을 보상하기 위해 몇 가지 추가 PCR 반응을 준비하는 것이 좋습니다.
2. 총 51웰(즉, 51 qPCR 반응)을 위해 96웰 qPCR 플레이트의 각 웰에 8μL의 PCR 프리믹스를 분취합니다. 부분 표본 분석 중에는 팁을 변경할 필요가 없습니다.
3. 2 μL의 열처리된 T7 파지 샘플 또는 T7 파지 참조 DNA를 각 웰에 추가합니다(그림 1B). 웰에 다른 DNA 샘플을 추가할 때 팁을 변경하여 교차 오염을 방지합니다. 또한 2 μL DNA 샘플을 qPCR 프리믹스 표면 아래(즉, 8 μL PCR 프리믹스)로 분주합니다.
4. qPCR 플레이트를 접착 필름으로 밀봉합니다.
   메모: 이 단계는 qPCR 플레이트의 유형에 관계없이 매우 중요합니다. 권장 키트를 사용하여 플레이트를 완전히 밀봉하십시오. 그렇지 않으면 플레이트의 밀봉되지 않은 영역이 PCR 사이클링 중에 부피 손실을 유발할 수 있습니다.
5. 형광 광표백을 최소화하기 위해 qPCR 플레이트를 알루미늄 호일로 감싸고 qPCR 장비에서 실행합니다.

2. qPCR 사이클링 조건

참고: qPCR 사이클링 조건은 특정 qPCR 장비에서 설정되었습니다.

1. qPCR 장비에서 96웰 qPCR 플레이트를 실행합니다. 장비의 메뉴에서 설정을 선택하여 다음 실험 조건을 설정합니다(그림 1C).
2. 10μL의 시료량에 대해 다음과 같이 사이클링 조건을 설정합니다: 50°C에서 1사이클에서 2분, 95°C에서 1사이클, 2분간 40사이클(95°C에서 15초, 60°C에서 1분). 그런 다음 용융 곡선 설정을 실행합니다: 95°C에서 15초, 60°C에서 1분, 95°C에서 15초의 1사이클
.
3. 데이터 분석을 진행합니다.

결과

그림 1: 파지 시료 처리, qPCR 반응 준비 및 qPCR 실행. DNase I 전처리된 T7 파지 샘플을 100°C에서 15분 동안 가열하여 온전한 파지 입자(A)에서 T7 DNA를 방출했습니다. qPCR 혼합물은 프로토콜에 기재된 바와 같이 제조하였다. 모든 준비는 얼음 (A)에서 이루어졌습니다. qPCR 장비 및 호환 가능한 소프트웨어(B)를 사용하여 사이클링 조건을 설정하고, PCR 사이클을 실행하고, 원시 데이터를 획득 및 분석했습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
T7 게놈 DNA를 위한 프라이머	증권 시세		F:CCTCTTGGGAGGAAGAGATTTG R:TACGGGTCTCGTAGGACTTAAT
T7 Select 패키징 컨트롤 DNA	EMD 밀리포어	69679-1UG
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