Microsphere Polymerase Chain Reaction to Amplify single-stranded DNA(단일 가닥 DNA를 증폭하기 위한 마이크로스피어 중합효소 연쇄 반응)

초록

출처: Lee, SH et al., 단일 가닥 DNA 앰플리콘에 대한 액적 기반 미세유체 접근법 및 미세구-PCR 증폭. J. Vis. 특급 (2018).

이 비디오는 단일 튜브 반응에서 올리고뉴클레오타이드로 코팅된 고분자 미세구를 사용하여 단일 가닥 DNA를 증폭하는 기술을 설명합니다. 이 과정을 통해 DNA 염기서열분석 및 마이크로어레이 분석에 추가로 사용할 수 있는 순수한 단일 가닥 DNA

가 생성됩니다.

프로토콜

1. ssDNA 증폭을 위한 비대칭 PCR

1. 분석할 ssDNA를 증폭하기 위한 비대칭 PCR 시약 혼합물을 준비합니다. 표 1의 시약을 얼음 위에서 해동합니다. Taq 중합효소(50 U/μL)를 얼음에 보관하지 말고 필요할 때까지 20 °C에서 보관하십시오.
2. 모든 시약을 부드럽게 와류로 회전시킨 다음 10,000 x g에서 10초 동안 원심분리 튜브를 잠시
소용돌이칩니다.
3. 표 1에 설명된 대로 모든 시약을 결합합니다.
4. 샘플을 thermocycler에 넣고 다음 조건에서 비대칭 PCR을 시작합니다: 25 사이클(95°C 30초, 52°C 30초, 72°C 30초), 85°C 5분, 4°C 유지.

2. ssDNA 증폭을 위한 Microsphere-PCR

참고: 이 섹션에서는 PCR 반응 튜브에서 ssDNA를 증폭하기 위한 프로토콜에 대해 설명합니다. Microsphere-PCR 반응은 50μL의 반응 부피에서 수행되었습니다. ssDNA를 증폭하는 데 사용되는 자세한 염기서열은 표 2에 나열되어 있습니다. 이 경우 미세구 표면의 Ap는 상보적인 방식으로 무작위 DNA 템플릿에 어닐링될 수 있습니다. 이것은 상보적인 DNA 가닥을 생성하기 위한 매우 중요한 단계입니다(안티센스 DNA 가닥, 그림 1). 확장된 DNA는 microsphere-PCR 증폭을 위한 템플릿으로 사용됩니다.

1. 마이크로스피어-PCR 시약 혼합물을 준비합니다. 표 3의 시약을 얼음 위에서 해동합니다. 그러나 Taq 중합효소를 얼음 위에 두지 마십시오. 필요할 때까지 -20 °C에서 보관하십시오.
2. 모든 시약을 부드럽게 와류로 회전시킨 다음 10,000 x g에서 10초 동안 원심분리 튜브를 잠시
소용돌이칩니다.
3. 현미경 계수를 통해 약 ~25개의 마이크로스피어를 얻습니다.
   메모: 하나의 반응 튜브에 있는 미세구의 수는 40X 배율의 광학 현미경을 사용하여 계산됩니다. 약 ~25개의 마이크로스피어가 마이크로스피어-PCR 증폭에 사용됩니다. 자세한 내용은 3단계에 나와 있습니다.
4. 표 3에 설명된 대로 모든 시약을 결합합니다.
5. 샘플을 thermocycler에 넣고 다음 조건에서 비대칭 PCR을 시작합니다: 25 사이클(95°C 30초, 52°C 30초, 72°C 30초), 85°C 5분, 4°C 유지.
6. 증폭 후 8μL의 6x 로딩 버퍼를 추가하고 각 샘플 15μL를 2% 아가로스 겔에 로드합니다. 그런 다음 1x TAE(Tris-acetate-EDTA, 40mM Tris-acetate, 1mM EDTA, pH 8.2) 버퍼에서 100V에서 35분 동안 전기영동을 수행합니다.

표 1. 20 μL 반응에서 비대칭 PCR 시약 혼합 성분.

개 개 개 개 개 의

시약	1x 반응에 대한 부피 (μL)	최종 집중
무작위 DNA 템플릿	1	1 ng/μL
태그 포워드 프라이머	1	0.4 μm
리버스 프라이머	1	0.02 μm
10X Taq 버퍼	5	1배
10mM의 dNTP	4	2.5 밀리미터.
엑스 타크 (1000U)	0.2	1 유
물	37.8	-
합계	50	-

표 2. Microsphere-PCR에 대한 염기서열 정보.

의 의 분

템플렛	순서	길이 (nt)
무작위 DNA 템플릿	5'- ATA CCA GCT TAT TCA ATT (랜덤 시퀀스, 40 mer) AGA TAG TAA GTG CAA TCT-3'	76
태그 포워드 프라이머 (Tag-F)	5'- GGT AAT ACG ACT CAC TAT AGG GAG ATA CCA GCT TAT TCA ATT-3'	42
리버스 프라이머	5'- AGA TTG CAC TTA CTA TCT-3'	18

표 3. 50 μL 반응에서 Microsphere-PCR 시약 혼합 성분

개 개 개 개 의

시약	1x 반응에 대한 부피 (μL)	최종 집중
Ap-마이크로스피어	~25 마이크로스피어	-
무작위 DNA 템플릿	1	1 ng/μL
태그 포워드 프라이머	1	0.4 μm
10X Taq 버퍼	5	1배
10mM 디엔피	4	2.5 밀리미터.
엑스 타크 (1000U)	0.2	1 유
물	37.8	-
합계	50	-

결과

그림 1: microsphere-PCR 프로토콜의 그림.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
40% 아크릴아미드:비스 용액 (19:1)	바이오 라드	1610140	Co-polymerizable oligo-microsphere의 구성 요소
과황산암모늄, APS	시그마 알드리치	A3678	아크릴아미드의 경화제:비스 용액
N,N,N',N'-테트라메틸에틸렌디아민, TEMED	시그마 알드리치	T9281	과황산암모늄의 촉매
미네랄 오일	시그마 알드리치	M5904	표 1. 솔루션 III. 마이크로스피어 시약의 성분
ssDNA 아크릴다이트 표지 프로브	바이오니아	합성	표 1. 해결책 I. 미세권 시약의 성분
트리스	비오상	T1016	TE 완충액, pH 완충액의 구성 요소
에디타	시그마 알드리치	EDS (에디에스)	TE 완충액의 성분, 이온 제거(Ca2+)
엑스 타크	다카라	RR001A	ssDNA 증폭
T100 써멀 사이클러	바이오 라드	1861096	ssDNA 증폭