특정 바이러스 게놈 염기서열을 검출하기 위한 Nested-PCR

초록

출처: Feng, Y., et al. 리사바이러스 검출을 위한 범용 중첩 역전사 중합효소 연쇄 반응 평가. J. Vis. 특급 (2019).

이 동영상은 두 개의 프라이머 세트를 사용하여 두 개의 순차적 PCR 증폭 프로세스로 구성된 기술인 중첩 중합효소 연쇄 반응에 대해 설명합니다. 프라이머의 첫 번째 세트는 두 번째 세트의 상류에서 서열에 어닐링하여 특정 유전자 서열을 선택적으로 증폭할 수 있습니다. 이 PCR은 일반 PCR보다 민감하고 특이도가 높으며 다양한 질병의 검출 기법으로 널리 사용되고 있습니다.

프로토콜

1. 바이러스 RNA의 역전사

1. 표 1에 나열된 RT 시약을 냉동실에서 꺼내 얼음 위에 보관하고 사용하기 전에 해동 및 와류로 만듭니다.
2. 표 1에 나열된 시약을 사용하여 0.2mL PCR 튜브에 12μL의 RT 반응 혼합물을 준비합니다. 필요한 것보다 하나 이상의 반응 크기가 큰 마스터 믹스의 부피를 준비하여 피펫팅 변형을 허용합니다.
3. 8 μL 샘플, 양성 대조군 RNA 또는 음성 대조군을 템플릿 룸의 PCR 워크스테이션 내 RT 반응 혼합물에 추가합니다. RT 양성 대조군은 고정 RABV 균주 CVS-11(챌린지 바이러스 표준-11)에 감염되어 -80°C에서 보관된 세포 배양에서 추출한 RNA입니다. 음성 대조군에는 RNase-free ddH₂O가 포함됩니다.
4. RT 튜브의 내용물을 꼭지점으로 혼합한 다음 간단히 원심분리합니다.
5. 반응 튜브를 열 순환기에 로드합니다. cDNA 합성 프로그램을 42°C에서 90분, 95°C에서 5분, 4°C 보류 조건으로 설정합니다. 반응 부피를 20 μL로 설정합니다.RT 실행을 시작합니다.

2. 1차 PCR

1. 표 2에 열거된 PCR 시약을 사용할 때까지 무균실에 있는 얼음에 지키십시오; 그 후에, 그(것)들을 녹이고 와동
시키십시오.
2. 표 2에 나열된 시약을 사용하여 0.2mL PCR 튜브에서 1차 PCR 혼합물을 준비합니다.
3. 2μL의 cDNA 또는 플라스미드 샘플을 템플릿 룸의 PCR 워크스테이션 내에서 1차 PCR 혼합물에 추가합니다. PCR 양성 대조군은 상기 RT 방법에 대해 1.3단계에서 언급한 바와 같이 제조된 CVS-11 cDNA입니다. PCR 음성 대조군은 dd H₂O입니다.
4. 밀봉된 튜브를 PCR 열 순환기로 옮기고 표 3에 나열된 매개변수를 사용하여 순환합니다.

3. 2차 PCR

1. 표 4에 나열된 시약을 사용하여 0.2mL PCR 튜브에서 2차 PCR 혼합물을 준비합니다.
2. 1차 PCR 산물 2μL를 2차 PCR 혼합물에 추가합니다. 또한,_ddH2O를 2차 PCR의 음성 대조군으로 포함시킨다.
3. 단계 2.4에서 주어진 것과 동일한 매개변수를 사용하여 PCR 열 순환을 실행하십시오.

표 1: cDNA 합성을 위한 역전사 시약.

개 개 개 개 세

구성 요소	반응당 부피(μl)
dNTP(2.5mM)	4
랜덤 프라이머(50μM)	1.5
올리고(dT) 15 (50 μM)	0.5
M-MLV 버퍼(5x)	4
M-MLV 역전사효소(200IU/μL)	1
RNasin(40IU/μL)	1
총 부피	12

표 2: 1차 PCR의 시약.

개 개 개 개 분

구성 요소	반응당 부피(μl)
dNTP(10mM)	1
Ex-Taq (5 U/μL)	0.3
Taq 버퍼(10x)	5
N127(20μM)	1
N829(20μM)	1
dd H2O	39.7
총 부피	48

표 3: 1차 및 2차 PCR의 사이클링 매개변수

개 분 분 분 분 개

온도	시간	주기
94 기음	2 분	1
94 기음	30 초	35
56 기음	30 초	35
72 기음	40 초	35
72 기음	10	1
4 기음	∞

표 4: 2차 PCR의 시약.

개 개 개 개 분

구성 요소	반응당 부피(μl)
dNTP(10mM)	1
Ex-Taq (5 U/μL)	0.3
Taq 버퍼(10x)	5
N371F(20μM)	1
N371R(20μM)	1
dd H2O	39.7
총 부피	48

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
ddH2O	다양한	다양한
dNTP(10mM)	다카라	4019
dNTP(2.5mM)	다카라	4030
Ex-Taq (5 U/μL)	다카라	RR001
마이크로 원심분리기 튜브	다양한	다양한
M-MLV 역전사효소(200IU/μL)	다카라	2641ᅡ
올리고 (dT)15	다카라	3805
PCR 기계	바이오 래드	T100
PCR 튜브	다양한	다양한
피펫터	다양한	다양한
랜덤 프라이머	다카라	3801
RNase 억제제(40 IU/μL)	다카라	2313ᅡ
RNase-free ddH2O	다카라	9102
Taq 버퍼(10x)	다카라	9152ᅡ
팁	다양한	다양한
와류 믹서	다양한	다양한