돌연변이 DNA 염기서열의 염기서열 변화를 결정하기 위한 고분해능 용융 PCR

초록

출처: Kisserli, A., et al. 보체 수용체 1 길이 다형성 유전형 분석을 위한 고해상도 용융 PCR: 알츠하이머병 유전자 감수성 평가를 위한 혁신적인 도구. J. Vis. 특급 (2017).

이 비디오에서는 용융 온도 분석을 기반으로 다양한 염기서열 길이의 DNA 단편의 길이 다형성을 결정하는 고해상도 용융 PCR 기술에 대해 설명합니다.

프로토콜

1. HRM-PCR 프로토콜

1. DNA 샘플을 해동합니다. 1.5mL 튜브의 DNA 샘플을 물로 희석하여 10ng/μL
   의 농도로 조정합니다. 메모: 희석된 DNA의 총 부피는 2 μL에서 10 μL 사이여야 합니다.
2. 프라이머 용액을 해동합니다. 1.5mL 튜브의 프라이머 용액을 물로 희석하여 6μM.
   의 동일한 농도로 조정합니다. 메모: 프라이머 서열 및 반응 조건은 표 1에 나와 있습니다.
3. HRM-PCR 키트 용액을 해동하고 모든 내용물의 회수를 보장하기 위해 와류로 조심스럽게 혼합합니다. DNA 결합 염료, MgCl₂ 및 물과 효소 혼합물이 들어 있는 3개의 바이알을 열기 전에 마이크로 원심분리기에서 간단히 회전시킵니다. 실온에 보관하십시오.
4. 실온의 1.5mL 튜브에 다음 성분을 아래 나열된 순서대로 추가하여 20μL 반응 1회를 위한 PCR 혼합물을 준비합니다.
   1. DNA 결합 염료를 사용한 10 μL의 효소 혼합물;
   2. 25mM MgCl₂의 2μL;
   3. 프라이머 1 μL, 6 μM (최종 농도 : 300 nM);
   4. 프라이머 2의 1 μL, 6 μM (최종 농도 : 300 nM); 및
   5. 5μL의 물.
      메모: 하나 이상의 반응에 대해 PCR mix를 준비하려면 위의 부피에 실행할 반응 수와 하나의 추가 반응을 곱합니다.
5. 볼텍싱으로 조심스럽게 섞습니다.
6. 위에서 준비한 PCR 혼합물 19μL를 흰색 멀티웰 플레이트의 각 웰에 피펫으로 넣습니다.
7. 농도 조정 DNA 템플릿 1μL를 추가합니다.
   메모: 대조군 반응의 경우, 항상 샘플에 대해 negative control을 실행하십시오. 음성 대조군을 준비하려면 템플릿 DNA를 물로 교체하십시오.
8. 흰색 멀티웰 플레이트를 밀봉 호일로 밀봉합니다.
9. 흰색 멀티웰 플레이트를 원심분리기에 놓고 적절한 균형추(즉, 다른 멀티웰 플레이트)로 균형을 맞춥니다. 1,500 x g에서 1분 동안 원심분리기를 사용하여 적절한 어댑터와 멀티웰 플레이트용 로터가 포함된 표준 스윙 버킷 원심분리기.
10. 흰색 멀티웰 플레이트를 HRM-PCR 기기에 로드합니다.
11. 다음 PCR 조건으로 HRM-PCR 프로그램을 시작합니다.
    변성 : 95 ° C 10 분; 1 주기.
    증폭 : 10 초 동안 95 ° C, 15 초 동안 62 ° C, 20 초 동안 72 ° C; 47 주기.
    용융 곡선 : 95 °C; 램프 속도: 0.02°C/s; °C당 25개의 획득; 1 주기.
    냉각 : 30 초 동안 40 °C; 램프 속도 2.2 °C / s; 1 사이클.

표 1: 고분해능 용융 해석에 사용되는 프라이머 및 파라미터.

2. CR1 길이 다형성을 결정하기 위한 HRM 분석

참고: 설명된 방법(그림 1)은 당사 소프트웨어에만 해당되지만(재료 표 참조), 다른 소프트웨어 패키지를 사용할 수도 있습니다.

1. 유전자 스캔 소프트웨어를 열어 CR1 길이 다형성 스캐닝 분석을 수행합니다.
2. 증폭 프로그램과 용융 곡선 프로그램이 포함된 실험을 엽니다.
3. 모듈 표시줄에서 Sample editor를 클릭한 다음 Scanning workflow를 선택합니다.
4. 샘플의 속성(즉, 이름, 알 수 없는 대조군 또는 음성 대조군)을 정의합니다.
5. 모듈 표시줄에서 분석을 클릭합니다.
6. Create New Analysis 목록에서 Gene Scanning을 선택합니다.
7. 정규화(Normalization) 탭을 클릭하여 용융 곡선을 정규화합니다.
8. 온도 이동(Temperature shift) 탭을 클릭하여 용융 곡선의 온도 축(x축)을 재설정합니다.
   메모: 아래 그래프는 정규화되고 온도 이동된 용융 곡선을 보여줍니다.
9. 계산 버튼을 클릭하여 결과를 분석하고 그룹화를 결정합니다.
10. 차트 영역에서 차이 플롯 탭을 클릭하여 Normalized and Shifted Melting Curves와 Normalized and Temperature Shifted Difference 플롯을 확인합니다.

결과

그림 1: 프로토콜의 2단계에서 사용된 소프트웨어의 그래픽 인터페이스 스크린샷. (A) 유전자 스캔 소프트웨어를 엽니다. (B) 증폭 프로그램 및 용융 곡선 프로그램. (C) 모듈 표시줄에서 샘플 편집기를 클릭합니다. (d) 스캔을 선택합니다. (E) 샘플의 특성을 정의합니다. (F) 모듈 표시줄에서 분석을 클릭합니다. (G) Normalization 탭을 클릭하여 용융 곡선을 정규화합니다. (H)

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
실험복			보호
SensiCare아이스 파우더 프리 니트릴 시험 장갑	Medline Industries, Inc, Mundelein, IL 60060, 미국	486802	시료 보호
Eppendorf Reference 2 피펫, 0.5-10μL	Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France	4920000024	시료 피펫팅
Eppendorf Reference 2 피펫, 20-100μL	Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France	4920000059	시료 피펫팅
Eppendorf Reference 2 피펫, 100-1000μL	Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France	4920000083	시료 피펫팅
TipOne 10μL 눈금, 필터 팁	Starlab GmbH, D-22926 아렌부르크, 독일	S1121-3810	시료 피펫팅
TipOne 1-100μL 베벨, 필터 팁	Starlab GmbH, D-22926 아렌부르크, 독일	S1120-1840	시료 피펫팅
ART 1000E 배리어 팁	Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, 프랑스	2079E	시료 피펫팅
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL, Eppendorf Quality	Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France	30120086	섞다
소용돌이 지니 2	Scientific Industries, Inc, 보헤미아, 뉴욕 111716, 미국	시-0236	섞다
Mikro 200 원심분리기	Hettich Zentrifugen, D-78532, 독일	0002020-02-00	원심 분리
멀티펫 E3	Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France	4987000010	분포
Light Cycler 480 멀티웰 플레이트 96, 흰색	Roche Diagnostics GmbH, D-68305 만하임, 독일	4729692001	반응 장소
Light Cycler 480 씰링 포일	Roche Diagnostics GmbH, D-68305 만하임, 독일	4429757001	보도
LightCycler 480 Instrument II, 96웰	Roche Diagnostics GmbH, D-68305 만하임, 독일	05015278001	고분해능 용융 중합효소 연쇄 반응
헤레우스 메가퓨지 11R 원심분리기	Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, 프랑스	75004412	원심 분리
LightCycler 480 고해상도 멜팅 마스터	Roche Diagnostics GmbH, D-68305 만하임, 독일	04909631001	반응 시약
CN3 프라이머: 5' ggccttagacttctcctgc 3'	Eurogentec Biologics Division, B4102 Seraing, 벨기에		반응 시약
CN3re 프라이머 : 5'gttgacaaattggcggcttcg 3'	Eurogentec Biologics Division, B4102 Seraing, 벨기에		반응 시약
light cycler 480 SW 1.5.1 소프트웨어	Roche Diagnostics GmbH, D-68305 만하임, 독일		HRM-PCR CR1 다형성 데이터 분석에 사용되는 소프트웨어

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