백혈구에서 DNA 메틸화를 검출하기 위한 다중 액적 중합효소 연쇄 반응

초록

출처: Malic, L., et al. 혈액 진단을 위한 폴리머 액적 발생기 장치를 사용한 메틸화 특정 다중 액적 PCR.J. Vis. 특급 (2020년)

이 동영상은 임상 진단 및 예후를 위한 조기 바이오마커로서 서로 다른 백혈구 집단에서 메틸화된 DNA 영역을 동시에 정량화하기 위한 다중 액적 중합효소 연쇄 반응 기술을 보여줍니다.

프로토콜

1. 액적 생성 및 PCR

참고: 표 1은 탈메틸화 유전자 표적의 다중 증폭에 필요한 C-LESS, CD3Z 및 Foxp3 유전자에 대한 이중 담금질 가수분해 프로브와 함께 순방향 및 역방향 프라이머에 대한 정보를 간략하게 설명합니다.

1. 표 2에 설명된 대로 마스터 믹스를 준비합니다.
2. 효소 믹스를 제외한 마스터 믹스의 모든 성분을 해동합니다. 위아래로 피펫팅하여 마스터 믹스를 철저히 혼합하고 짧게 회전시킵니다.
3. PCR 튜브의 마스터 믹스에 적절한 부피(1μL)의 중아황산염으로 전환된 DNA를 추가합니다. 피펫팅을 위아래로 하여 반응을 혼합하고 짧게 스핀다운합니다.
4. PEEK 피팅을 사용하여 일회용 유체 튜브(I.D. 0.25mm, O.D. 1.6mm)를 두 개의 정밀 유리 주사기(250μL 용량)에 연결합니다.
5. 5% 불소 계면활성제가 함유된 250μL의 캐리어 오일로 정밀 유리 주사기 1개를 미리 채웁니다.
6. 유화 중에 전체 시료 부피의 분주를 보장하기 위해 PCR 혼합물 100μL를 로드하기 전에 다른 정밀 유리 주사기에 50μL의 캐리어 오일을 미리 채웁니다.
7. 고속 카메라가 장착된 직립 광 현미경의 스테이지에 액적 미세유체 장치를 설치하여 액적 형성을 실시간으로 관찰하고 기록합니다.
8. 미리 채워진 주사기를 프로그래밍 가능한 주사기 펌프에 놓고 피팅이 있는 PEEK 유니온(재료 표 참조)을 사용하여 주사기의 튜브를 액적 미세유체 장치의 각 입구 채널의 튜브에 연결합니다.
9. 액적 발생기의 배출구에서 튜브를 0.5mL PCR 튜브 내부에 놓습니다.
10. 주사기 펌프의 유속을 2 μL/min으로 조정하고 결과 에멀젼을 수집하기 전에 액적 크기가 안정화되도록 합니다.
11. 에멀젼을 수집하고 열 순환을 위해 75μL를 0.2mL PCR 튜브로 옮깁니다.
12. PCR 튜브의 오일 함량이 열 순환 중에 방울의 유착을 방지하기 위해 분산된 상의 부피와 밀접하게 일치하는지 확인하십시오.
13. 0.2mL PCR 튜브를 열 순환기에 넣고 다음과 같이 사이클링 프로토콜을 수행합니다: 95°C에서 5분 동안 예열한 다음 95°C에서 15초 동안 변성 45주기, 60°C에서 30초 동안 어닐링/연장
.

표 1: 프라이머 및 가수분해 프로브 설계.

FOXP3 포워드	GGG TTT TGT TGT 탓 AGT TTT TG
FOXP3 리버스	TTC TCT TCC TCC 아타 아타 TCA
CD3Z 앞으로	GG TGG TTG TGG TGA AAA GTG
CD3Z 리버스	CAA, AAA, CTC, CTT, TCC, 타아, CCA
C-LESS 포워드	TTG 탓 GTA TGT 개그 TGT GGG AGA GA
C-LESS 리버스	TTT, CTT, CCA, CCC, CTC, TTC C
FOXP3 프로브	/56-FAM/CA ACA CAT C/ZEN/C AAC CAC CAT/3 IABkFQ/
CDZ3 프로브	/56-HEX/CC AAC CAC C/ZEN/A CTA CCT CAA /3IABkFQ/
C-Less 프로브	/56-CY5/CT CCC CCT C/젠/T AAC TCT AT/3IABkFQ/

표 2: mdPCR의 마스터 믹스 레시피.

시약	재고 솔루션	마스터 믹스 볼륨	작업 집중
트리스 - HCl	1 미터	2 μL	20 밀리미터미터
케이클	1 미터	10 μL	100 밀리미터미터
재질 보기 MgCl2	25 밀리미터미터	16 μL	4 밀리미터의
C-LESS 프라이머	10 μM	10 μL	각 1μM
CD3Z 프라이머	10 μM	10 μL	각 1μM
FOXP3 입문서	10 μM	10 μL	각 1μM
C-LESS 프로브	10 μM	5 μL	500nM
CD3Z 프로브	10 μM	5 μL	500nM
FOXP3 프로브	10 μM	5 μL	500nM
HotStarTaq DNA 중합효소	5 단위/μL	8 μL	0.4 단위/μL
중아황산염 처리된 DNA 타겟	변수	변수	변수
뉴클레아제가 없는 물		변수
총 볼륨		100 마이크로L

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
PCR 튜브	Bio-Rad, 미시소거, ON	TFI0201
불소 계면활성제	RAN Biotechnologies, 매사추세츠주 베벌리	008-플루오로계면활성제
일회용 유체 튜브	백 운 석	3200063
일회용 유체 튜브	백 운 석	3200302
PEEK 피팅	IDEX Health & Science, 워싱턴주 오크	P-881
캐리어 오일	3M, 세인트폴, MN
정립 광학 현미경	니콘, 멜빌, 뉴욕

하버