단일 뉴클레오티드 변이체의 정량화를 위한 Chip-in-a-tube 기반 디지털 PCR

초록

출처: Kahyo, T., et al. chip-in-a-tube 형식을 사용하는 산발성 가족성 선종성 용종증 환자의 유전적 변이에 대한 디지털 중합효소 연쇄 반응 분석. J. Vis. 특급 (2018).

이 비디오는 DNA 샘플에서 단일 뉴클레오티드 변이를 검출하기 위한 chip-in-a-tube 형식의 디지털 PCR의 유용성을 보여줍니다. 단일 PCR 반응은 독립적인 PCR 반응으로 작용하는 챔버로 분할되며, 챔버 내 증폭된 표적에서 형광 신호를 검출하는 것은 샘플 내 변이 대립유전자의 빈도를 계산하는 데 사용됩니다.

프로토콜

1. 게놈 DNA의 품질 관리

참고: 게놈 DNA(gDNA)는 잘 정립된 실리카막 기반 DNA 정제 방법을 사용하여 말초 혈액에서 추출되었습니다. 아래 절차에 앞서, 분광 광도계를 사용하여 gDNA의 농도를 측정했습니다.

1. gDNA 샘플을 10-100ng/μL의 농도로 준비합니다.
2. 10 μL의 DNA 시료 완충액을 8-튜브 스트립에 추가합니다.
3. 1 μL의 DNA ladder 또는 gDNA를 튜브에 추가합니다. 마이크로플레이트 부착물을 사용하여 혼합물을 1분 동안 볼텍스합니다.
4. 튜브, 겔 장치 및 피펫 팁을 전기영동 기기(Table of Materials)에 넣고 '시작' 버튼을 눌러 실행을 시작합니다.
   메모: 전기영동 시스템은 시작 버튼을 한 번만 클릭하면 자동으로 작동합니다.
5. DNA 샘플 버퍼에 포함된 하단 마커가 전기영도형에 올바르게 할당되었는지 확인합니다. 잘못 할당된 경우 소프트웨어의 'Electroherogram 모드'에서 마커를 수동으로 할당하십시오.
   메모: DNA 무결성 번호(DIN)가 자동으로 계산됩니다. DIN 값은 DNA 무결성에서 비롯됩니다. 높은 DIN 값과 낮은 DIN 값은 각각 gDNA가 매우 온전하고 심하게 분해되었음을 나타냅니다.
6. 소프트웨어의 '영역 모드'에서 gDNA의 크기 영역(> 200 bp)을 지정하여 gDNA의 농도(> 200 bp)를 자동으로 계산합니다.

2. 입문서 및 프로브 설계

1. 10-25 염기, 50 mM Na⁺/K⁺, 0.80 mM dNTP 및 3 mM Mg²⁺(재료 표) 조건에서 개방형 액세스 도구를 사용하여 용융 온도(T_m) 값을 계산합니다. T_m 값이 약 60 °C이고 앰플리콘 길이가 100-300 bp.
   인 타겟 대립유전자를 포함하는 게놈 영역을 증폭하도록 정방향 및 역방향 프라이머를 설계합니다. 참고: 올리고뉴클레오티드의 농도는 표 1을 참조하십시오.
2. 다음 조건에 따라 참조 및 변이 대립유전자에 대한 고정 핵산(locked nucleic acid, LNA) 프로브를 설계합니다: (i) 각 프로브에 1-6개의 LNA가 존재합니다. (ii) 형광 염료와 소광제가 각 프로브의 5' 및 3' 말단에 각각 존재합니다. (iii) 일치하는 프로브와 일치하지 않는 프로브의 T_m 값 간의 차이는 10 ° C>입니다. (iv) 정합된 프로브와 일치하지 않은 프로브_{의 TM 값은} 각각 프라이머의 값보다 높거나 낮습니다[예: 정방향 프라이머: 60.8°C, 역방향 프라이머: 59.8°C, 기준 대립유전자 프로브(일치/불일치): 62.6/45.3°C, 변이 대립유전자 프로브(일치/불일치): 61.7/50.5°C]. T_m 값은 2.1단계에서도 사용된 오픈 액세스 도구를 사용하여 계산되었습니다.
3. 설계된 프라이머 및 프로브가 데이터베이스[예: 단일 뉴클레오티드 다형성 데이터베이스(dbSNP)]에서 결정된 바와 같이 빈도가 > 0.1%인 단일 뉴클레오티드 다형성을 포함하지 않는지 확인합니다.

3. 디지털 PCR

1. TE 완충액을 사용하여 프라이머, 프로브 및 gDNA 원액을 표 1에 기재된 농도로 준비하고 -20–4 °C에서 보관합니다.
2. 표 1에 설명된 대로 총 부피 15μL의 시약을 실온에서 최종 농도로 혼합합니다.
   1. NTC(No-template control)에서 gDNA 대신 증류수 3μL를 추가합니다.
   2. 피펫팅 오류를 설명하기 위해 PCR 혼합물의 3.5배를 3배로 준비합니다.
3. PCR 혼합물을 위아래로 피펫팅하여 혼합합니다.
4. 8-튜브 스트립에 내장된 칩에 로딩 플랫폼을 설정하고 오토로더에 설정합니다. 칩과 로딩 플랫폼 사이에 접촉이 있는지 확인하십시오.
5. 플랫폼에 로딩 슬라이더를 끼우고 로더에서 스토퍼를 분리한 상태로 슬라이더를 잡습니다.
6. 슬라이더 팁 근처의 플랫폼에 PCR 혼합물 15μL를 피펫팅합니다(그림 1A).
7. 로더의 버튼을 눌러 로더를 실행합니다(약 1분 동안).
   메모: 플랫폼에 소량의 PCR 혼합물이 남아 있으면 문제가 되지 않습니다. 로더를 순차적으로 다시 실행할 수 있습니다.
8. PCR 혼합물로 채워진 chip-in-a-tube를 밀봉 인핸서의 측면 슬롯에 놓습니다. 칩이 파손되지 않도록 슬라이드 덮개와 상단 덮개의 가장자리를 누릅니다(그림 1B).
9. 밀봉 인핸서를 실행합니다(약 2분). 불완전한 밀봉으로 인해 양성 신호의 교차 오염이 발생하기 때문에 액체 웅덩이가 여전히 보이는 경우 밀봉 인핸서를 1분 동안 순차적으로 다시 실행합니다(그림 1C 및 1D).
10. 유성 시약인 밀봉 유체 230μL를 튜브에 추가합니다.
    메모: 이제 칩이 유체에 가라앉아야 합니다.
11. 열 순환기에 튜브를 설정합니다. 표 2에 설명된 대로 열 순환기를 실행합니다(약 2시간 동안). 양성 파티션의 고르지 않은 분포가 있는 경우 PCR 온도 또는 지속 시간을 조정합니다(그림 1E).
    알림: 램프 속도를 약 1°C/s로 설정하는 것이 좋습니다.
12. 기준선 소음을 줄이기 위해 열 순환기의 튜브를 최소 15분 동안 그대로 두십시오.
    메모: 튜브는 밤새 그대로 둘 수도 있습니다. 형광 신호는 다음 날에도 감지되었습니다.
13. 감지 지그에 튜브를 놓고 증류수 6mL를 지그에 붓습니다. 튜브 내부와 외부에 기포가 보이면 청소하십시오(그림 1F 및 1G).
14. 지그를 검출기에 로드하고 형광, 실험 및 샘플/NTC 탭(재료 표)을 선택한 후 소프트웨어의 '실행' 버튼을 클릭하여 실행합니다.
    참고: 기본 강도로 8개 샘플의 이중 색상 감지는 약 4 - 5분 정도 걸립니다.
15. 위치 플롯, 히스토그램 및 2D 산점도를 확인합니다.
    참고: 네거티브 파티션의 형광 강도가 높으면 소프트웨어의 설정 버튼을 클릭하여 강도를 조정하여 30-70 범위 내에 있도록 합니다.
16. 다음 공식을 사용하여 변형 대립유전자 분율(VAF)을 계산합니다.
    
    여기서 Cv 및 Cr은 각각 변이체와 참조 대립유전자의 복제 수입니다.
    메모: 푸아송 통계를 기반으로 소프트웨어 프로그램에서 자동으로 계산됩니다.

4. PCR 산물 수집

1. 튜브에서 밀봉액을 제거합니다.
2. 튜브에 100μL의 TE 완충액을 추가합니다. 30초 동안 격렬하게 소용돌이치고 튜브를 짧게 원심분리합니다.
3. TE 용액을 다른 튜브로 옮기고 30μL의 3M 아세트산나트륨과 200μL의 에탄올을 추가합니다.
4. 용액을 -20°C에서 밤새 냉각합니다.
5. 용액을 16,000 x g에서 30분 동안 원심분리하고 상층액을 제거합니다.
6. 300μL의 80% 에탄올을 튜브와 와류에 추가합니다.
7. 용액을 16,000 x g에서 15분 동안 원심분리하고 상층액을 제거합니다. 침전물을 5분 동안 자연 건조시킵니다.
8. 공기 건조 후 침전물을 1–5 μL의 TE 완충액에 용해시킵니다.
9. 필요한 경우 1단계를 참조하여 전기영동 기기를 사용하여 제품 크기를 평가합니다. 고감도를 위해 용액 1μL를 젤 장치에 로드합니다(Table of Materials).

결과

그림 1: chip-in-a-tube 형식의 dPCR 분석에 대한 참고 사항.(A) 이 패널은 오토로더에서 8-튜브 스트립을 설정하는 방법을 보여줍니다. (B) 이 패널에는 깨진 칩이 표시됩니다. (C) 이 패널은 (i) 로딩 및 (ii) 밀봉 직후 칩이 어떻게 표면화되는지 보여줍니다. (iii) 불완전한 밀봉의 경우 액체 웅덩이가 보입니다. (D) 이 패널은 교차 오염의 경우 위치 플롯을 보여줍니다. (E) 이 패널은 불균일 분포의 경우 위치 플롯을 보여줍니다. (F) 이 패널은 튜브 표면의 기포가 물에 어떻게 잠기는지 보여줍니다. (

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
QIAamp DNA 블러드 맥시 키트	키아겐	51194	프로토콜 1 이전: 게놈 DNA 추출
나노드롭 1000	ThermoFisher 사이언티픽	노스다코타-8000	프로토콜 1 이전: 분광광도계
8-스트립 튜브	애질런트 테크놀로지스	401428	프로토콜 1
게놈 DNA 샘플 버퍼	애질런트 테크놀로지스	5067-5366	프로토콜 1:
			게놈 DNA 스크리닝 테이프 분석의 구성 요소
DNA 사다리	애질런트 테크놀로지스	5067-5366	프로토콜 1:
			게놈 DNA 스크리닝 테이프 분석의 구성 요소
MS3 기본 소형 셰이커	이카	3617000	프로토콜 1: 와류 믹서
게놈 DNA 스크리닝 테이프	애질런트 테크놀로지스	5067-5365	프로토콜 1: 젤 장치
2200 TapeStation 시스템	애질런트 테크놀로지스	G2965AA	프로토콜 1: 전기영동 기기
TapeStation 분석 소프트웨어	애질런트 테크놀로지스	G2965AA와 함께 번들로 제공	프로토콜 1: 분석 소프트웨어
DNA 올리고 프라이머	증권 시세	맞춤 주문	프로토콜 2
LNA 프로브	증권 시세	맞춤 주문	프로토콜 2
소프트웨어 도구	증권 시세	웹 사이트: http://biophysics.idtdna.com/	프로토콜 2
dbSNP 데이터베이스	엔씨비	웹 사이트: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/	프로토콜 2
TE 버퍼	ThermoFisher 사이언티픽	12090015	프로토콜 3
DNase/RNase-Free 증류수	ThermoFisher 사이언티픽	10977015	프로토콜 3 (표 1)
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Clarity 튜브 스트립	제이앤이 메드시스	12007	프로토콜 3: 칩-인-튜브(Chip-in-a-tube)
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Clarity 시료 로딩 키트	제이앤이 메드시스	12008	프로토콜 3: 로딩 플랫폼 및 슬라이더
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Clarity 자동 로더	제이앤이 메드시스	11002	프로토콜 3: 자동 로더
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Clarity Sealing Enhancer (투명도 밀봉 인핸서	제이앤이 메드시스	11003	프로토콜 3: 밀봉 강화제
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Clarity 리더	제이앤이 메드시스	11004	프로토콜 3: 리더
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라이프 에코 써멀 사이클러	Bioer 기술	TC-96GHbC	프로토콜 3: 열 순환기
Clarity 소프트웨어	제이앤이 메드시스	#10001과 번들로 제공	프로토콜 3: 분석 소프트웨어
고감도 D1000 스크린 테이프	애질런트 테크놀로지스	5067-5584	프로토콜 4: 고감도를 위한 젤 장치