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인간 참가자와 관련된 모든 절차는 인간 복지를 위한 제도적, 국가적, 국제적 지침에 따라 수행되었으며 지역 기관 검토 위원회의 검토를 거쳤습니다.
참고: 이 절차는 인간의 신선 냉동 조직에서 적은 수의 cDNA 분자를 검출하기 위해 특별히 설계되었습니다. 조직 절편은 이전에 검증된 환자 유래 위 종양 또는 정상 조직 샘플에서 아직 얼어붙은 상태에서 드라이아이스로 절단되었습니다.
1. RNA 분리 및 정제
- RNA 추출
메모: RNA 분리는 특정 산물을 사용하여 내부에서 수행됩니다(재료 표 참조). 그러나 다양한 분리 키트가 상업적으로 이용 가능합니다.
- 1.5 mL 튜브에 50 - 100 mg의 미세하게 절단된 신선 냉동 조직 샘플을 1 mL의 RNA 분리 시약과 함께 균질화하고 15초 동안 격렬하게 소용돌이칩니다. -80 °C에서 밤새 튜브를 배양합니다.
- 샘플이 들어있는 튜브를 실온에서 5분 동안 배양하고 15초 동안 볼텍싱하여 혼합합니다.
- 튜브를 얼음 위에 놓고 클로로포름 200μL를 넣고 15초 동안 격렬하게 소용
돌이칩니다.
- 튜브를 실온에서 60초 동안 배양하고 12,000 x g에서 4°C에서 15분 동안 원심분리합니다.
- 수성상을 1.5mL 튜브로 옮기고 20μg의 글리코겐을 추가합니다.
메모: 오염을 줄이기 위해 계면 또는 유기 층이 이동하지 않도록 주의하는 것이 중요합니다.
- 500μL의 이소프로판올을 넣고 튜브를 뒤집어 섞은 다음 얼음 위에서 10분 동안 배양합니다.
- 12,000 x g에서 4°C에서 15분 동안 튜브를 원심분리하여 RNA를 침전시킵니다.
메모: RNA는 튜브의 측면과 바닥에 있는 젤 같은 펠릿에 존재하며 원심분리 후에는 종종 보이지 않습니다.
- 침전물을 방해하지 않고 상층액을 제거하고 피펫팅으로 75% 에탄올 1mL로 세척합니다.
- 튜브를 7,500 x g에서 4°C에서 5분 동안 원심분리하고 펠릿을 방해하지 않고 상층액을 제거합니다.
- 침전물이 투명해질 때까지 펠릿을 건조시키고 RNase가 없는 물 50μL에 용해시킵니다.
- 정량화하기 전에 적어도 하룻밤 동안 샘플을 -80°C에서 동결하십시오.
- 게놈 DNA 제거 및 RNA 정제
메모: DNase 분해 단계 후 컬럼 기반 RNA 정제는 오염된 DNA를 분해하기 위해 저농도 표적 분석에 권장됩니다.
- 동결건조된 DNase I(1,500 Kunitz 단위)을 주사기를 사용하여 RNase가 없는 물 550μL에 용해시키고 바이알을 뒤집어 부드럽게 혼합한 후 재구성된 원액을 분취액으로 분할합니다.
- 1.5mL 튜브에 RNA 15μg, 키트의 DNase 분해 완충액 10μL(재료 표에 나열됨), DNase I 원액 2.5μL 및 RNase-free 물과 함께 계산된 시료 부피를 100μL로 옮깁니다.실온에서 10분 동안 배양합니다.
- 350 μL의 조직 용해 완충액(키트에서, 재료 표 참조)을 추가하고 피펫팅으로 혼합합니다.
- 250μL의 100% 에탄올을 첨가하고 피펫팅으로 혼합합니다.
- 전체 부피(700μL)를 새 스핀 컬럼으로 옮기고 12,000 x g에서 15초 동안 원심분리합니다.
- 필터를 새 수집 튜브로 옮기고 컬럼에 500μL의 80% 에탄올을 추가한 다음 12,000 x g에서 2분 동안 원심분리합니다.
- 스핀 컬럼의 뚜껑을 열고 새 수집 튜브로 12,000 x g에서 5분 동안 원심분리하여 필터를 건조시킨 다음 필터를 1.5mL 튜브로 옮깁니다.
- RNase가 없는 물 14μL를 필터 컬럼에 직접 추가하고 1분 동안 12,000 x g에서 원심분리합니다.
- 샘플을 얼음 위에 보관하고 벤치탑 분광 광도계에서 2 μL의 샘플을 사용하여 정량화를 진행하거나 사용할 때까지 RNA를 -80 °C에서 보관합니다.
2. 디지털 PCR 반응 설정
- dPCR 반응 혼합물 및 시료 준비
- 마스터 믹스와 분석을 실온에서 최소 20분 동안 해동합니다.
- cDNA 샘플을 6μL의 물에 300ng의 농도로 희석합니다.
- 마스터 믹스를 부드럽게 와류로 회전시키고 8.7 μL의 마스터 믹스, 0.87 μL의 CDH1a 맞춤형 분석 프라이머, 1.83 μL의 뉴클레아제가 없는 물과 함께 11.4 μL.
의 최종 부피를 위해 혼합물을 준비합니다.
메모: CDH1a 맞춤형 분석 프라이머에 대한 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오.
- 준비된 혼합물 11.4 μL를 희석된 cDNA 샘플로 옮기고, 부드럽게 혼합한 후 간단히 원심분리를 합니다.
메모: 부피에는 파이펫팅으로 인한 부피 손실을 보상하기 위해 20% 초과분이 포함됩니다. 모든 샘플과 NTC(템플릿 제어 없음)에 대한 혼합물을 준비합니다.
- 칩 준비
참고: 최적의 결과를 얻으려면 가능한 한 빨리 칩을 로드하십시오.
- 칩 로더를 연결하고 표시등이 녹색으로 바뀔 때까지 기다립니다.
- 이 단계를 용이하게 하기 위해 플런저를 1 - 2mm 부드럽게 뒤로 당겼다가 풀어 침지 유체 주사기의 캡을 제거하고 팁으로 교체합니다.
- 새 칩을 가져다가 뚜껑에 쓰여진 코드를 기록하여 샘플과 연결합니다.
- 뚜껑을 옆으로 조심스럽게 잡고 보호 필름을 벗겨낸 후 끈적한 면이 위로 향하게 하여 뚜껑을 올바른 방향으로 놓습니다.
- 내부 부품을 만지지 않도록 주의하면서 칩을 조심스럽게 집어 올리고 레버를 눌러 클램프를 열어 올바른 위치의 칩 네스트에 로드합니다.
- 새 적재 블레이드를 로더에 적재하고 부드럽게 밀어 제자리에 단단히 고정되었는지 확인합니다.
- 기포를 만들거나 블레이드를 편향시키지 않고 dPCR 반응 혼합물 14.5μL를 로딩 블레이드로 옮긴 후 검은색 로딩 버튼을 눌러 칩의 부피를 분배합니다.
- 침지 유체 주사기를 사용하여 팁이 있는 표면을 만지지 않도록 주의하면서 칩 표면에 약 20방울을 떨어뜨립니다.
메모: 가장자리로 액체를 흘리지 않고 전체 표면을 덮는 것이 중요합니다.
- 로더 암을 회전하여 덮개가 칩에 닿도록 하고 15초 동안 아래로 누릅니다.
- 덮개 버튼을 눌러 칩을 분리하고 암을 원래 위치로 되돌립니다.
- 조립된 칩을 45° 각도로 잡고 주입 포트를 통해 주사기와 함께 침지 유체를 조심스럽게 분배하고 칩을 약간 회전하여 기포가 없는지 확인한 다음 멸균 천으로 여분의 유체를 제거합니다.
- 칩 뚜껑 상단의 라벨을 부드럽게 떼어내어 칩 케이스를 밀봉하고 주입 포트를 최소 5초 동안 누릅니다.
- 열 순환기에 로드할 준비가 될 때까지 칩을 어두운 곳에 보관하십시오.
메모: 준비된 칩은 2시간 이내에 사용해야 합니다.
- dPCR 반응
- 덮개를 열고 단일 블록을 사용하는 경우에도 두 블록에 어댑터를 설치합니다.
- s에 칩을 놓습니다.amp올바른 위치에 블록을 놓습니다.
메모: 채우기 포트는 칩의 창을 방해하지 않고 기포가 상단으로 떠오를 수 있도록 높은 위치에서 열 순환기의 전면을 향해야 합니다. 빈 칩을 사용하여 두 블록의 균형을 맞춥니다.
- 열 패드를 s에 놓습니다.amp칩을 완전히 덮는 블록.
- 뚜껑을 닫고 PCR 실행을 시작하여, 뒤에 오는 조건을 적용하십시오: 10 분 동안 96 °C에 보전하십시오; 30 초 동안 2 분 동안 60 °C와 98 °C의 45 주기; 2 분 동안 60 °C에 보전하십시오; 4 °C에 보전하십시오. 열 cycler를 끄고 적어도 10 분 동안 실내 온도에 칩을 녹이십시오.
메모: 칩 분석은 1시간 이내에 수행해야 합니다.
- 칩 분석
- 기기의 뚜껑을 열고 열 패드를 제거한 다음 어댑터에서 칩을 제거합니다.
메모: 분석할 때까지 칩을 어둡고 깨끗한 장소에 보관하십시오.
- 이소프로판올과 멸균 물티슈로 칩 표면을 청소합니다.
메모: 각 칩에 누출 또는 잠재적인 문제가 있는지 검사합니다.
- USB를 감지기 시스템에 삽입하여 데이터를 저장하십시오.
- 검출기 시스템의 칩 트레이를 열고 칩을 앞면이 위로 향하게 하여 올바른 위치에 로드한 다음 트레이를 닫습니다.
- 처리를 위해 30초 동안 기다린 후 칩을 제거하고 다음 칩을 삽입합니다.
- 처리된 모든 칩에 대한 분석이 완료될 때까지 기다린 다음 USB를 컴퓨터에 삽입하여 파일을 전송합니다.
메모: 분석을 위한 총 시간은 칩당 약 2-3분입니다.
3. 데이터 분석 및 해석
- 모든 다운스트림 분석을 수행하는 데 필요한 클라우드 기반 소프트웨어 플랫폼에 연결합니다.
- 프로젝트를 만들고 관심 칩의 모든 데이터 파일을 가져옵니다.
- 샘플 이름을 입력하고 "Define Chips" 탭에서 사용되는 염료와 어세이를 선택합니다.
- "Review Data" 탭에서 칩을 시각화하여 샘플이 칩에 얼마나 철저하게 로드되었는지, 평가 가능한 데이터 포인트 수를 확인하여 칩이 허용 가능한지 확인합니다.
메모: 평가 가능한 데이터 포인트가 13,000개 미만인 칩을 리젝트합니다.
- 화면 오른쪽에 있는 선택한 칩의 산점도로 이동합니다. 모든 칩에 FAM(fluorescein amidite) 리포터 염료 신호(Y축)에 대한 임계값 6,000을 적용합니다.
메모: 임계값 설정은 사용된 분석에 따라 달라질 수 있습니다.
- 올가미 도구를 사용하여 산점도에서 상대 지점을 선택하고 "unetermined"를 눌러 거짓 긍정 결과를 방지하려면 모호한 긍정 신호를 제거합니다. 남아 있는 모든 양성 반점은 분석된 희귀 표적의 cDNA 사본이 있음을 나타냅니다.