In Vitro Culture and Differentiation of Primary Monocytes into Macrophages

초록

출처: Plaisance-Bonstaff, K., et al. Isolation, Transfection, and Culture of Primary Human Monocytes. J. Vis. 특급. (2019년)

이 비디오는 일차 단핵구를 대식세포로 프라이밍하는 방법을 보여줍니다. 1차 인간 단핵구는 과립구-대식세포 집락자극인자(GM-CSF)를 사용하여 M1-like 전염증성 표현형으로 분리 및 분화할 수 있으며, 대식세포 집락자극인자(M-CSF)를 사용하여 M2-like 항염증성 표현형으로 분화할 수 있습니다.

프로토콜

인간 참가자와 관련된 모든 절차는 인간 복지를 위한 제도적, 국가적, 국제적 지침에 따라 수행되었으며 지역 기관 검토 위원회의 검토를 거쳤습니다.

1. 면역자기 음성 선택에 의한 일차 인간 단핵구의 분리

1. 4개의 10mL 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) 진공관(튜브당 혈액 10mL)에 신선한 인간 전혈 40mL(HIV⁺ 환자 또는 건강한 대조군으로부터)를 수집합니다. 생물 안전 작업대에서 멸균 기술을 사용하여 40mL의 혈액을 모두 하나의 50mL 원추형 프로필렌 튜브로 옮깁니다.
2. 선택한 인간 단핵구 분리 키트에 대한 제조업체의 프로토콜(Table of Materials)에 따라 키트에 제공된 단핵구 분리 칵테일 2mL를 혈액 튜브에 추가합니다. 키트에 제공된 Vortex 마그네틱 비드를 30초 동안 사용하고 혈액 튜브에 2mL를 추가합니다.
   1. 사용할 수 있는 혈액이 40mL 미만인 경우 추가된 시약을 축소합니다. 용액을 혼합하려면 플라스틱 25mL 혈청학적 피펫을 위아래로 피펫하고 실온(RT)에서 5분 동안 배양합니다.
3. 혈액 혼합물을 4개의 50mL 튜브에 균등하게 분리하고 각 튜브에 1mM EDTA를 함유한 30mL의 멸균 인산염 완충 식염수(PBS)를 추가합니다. 플라스틱 25 mL 혈청학 피펫으로 위아래로 피펫팅하여 혼합합니다.
4. 튜브를 자석 홀더에 10분 동안 넣어 항체 접합 자성 비드를 제거합니다. 각 튜브에 하나씩 4개의 자석 홀더를 동시에 사용하여 각 혈액 샘플에 대해 일관된 배양 및 분리 시간을 허용합니다.
5. 자석 홀더에 있는 동안 피펫을 사용하여 각 튜브의 중앙에서 내용물을 끌어올립니다. 적혈구(10mL 시작 부피의 10% 이하)를 추출하지 않도록 주의하고 내용물을 4개의 새로운 50mL 튜브 중 하나에 넣습니다.
6. 각 50 mL 튜브에 500 μL의 볼텍스된 마그네틱 비드를 추가합니다. 25mL 피펫으로 위아래로 피펫팅하고 RT에서 5분 동안 배양합니다. 그런 다음 튜브를 자석 홀더에 5분 동안 놓습니다.
7. 자석 홀더에 있는 동안 각 튜브의 중앙에서 내용물을 4개의 새로운 50mL 튜브 중 하나로 조심스럽게 옮깁니다. 각각의 새 50mL 튜브를 자석 홀더에 5분 동안 직접 놓습니다.
8. 각 튜브의 중앙에서 4개의 새로운 50mL 튜브 중 하나로 내용물을 조심스럽게 옮깁니다. 모든 새 50 mL 튜브를 300 x g에서 5분 동안 회전시킵니다. 상층액을 흡인하고 4개의 세포 펠릿을 모두 총 10mL의 멸균 PBS에 재현탁합니다.
9. hemocyometer.
   를 사용하여 trypan blue exclusion으로 세포 수를 계산합니다. 참고: 8-20 x 10⁶ 세포는 일반적으로 40mL의 전혈에서 얻습니다.

2. 일차 인간 단핵구의 배양

1. 37°C 수조를 사용하여 1% 페니실린-스트렙토마이신(pen/strep)이 보충된 따뜻한 무혈청 RPMI 1640 배지를 사용하고(생물 안전성 캐비닛에서 멸균 기술을 계속 사용하면서) 이 배지에서 분리된 단핵구를 1 x 10⁶ cells/mL의 농도로 재현탁합니다.
2. 1mL의 재현탁 세포를 6웰 플레이트의 각 웰 또는 35mm 접시에 추가하고(최종 세포 수는 1 x 10⁶ 세포/플레이트여야 함) 5% CO₂가 있는 37°C 인큐베이터에 넣습니다. 세포가 부착될 때까지 0.5-1.0시간 동안 기다립니다.
3. 37°C 수조를 사용하여 온열 불활성화(HI) 소 태아 혈청(FBS)을 사용합니다. 각 플레이트에 FBS 100μL(최종 농도 10%)를 추가합니다. 세포에 성장 인자를 추가하여 대식세포 분화를 촉진합니다.
   1. 배지에 25ng/mL의 과립구-대식세포 집락자극인자(GM-CSF)를 첨가하여 M1 유사 표현형을 위한 프라임 대식세포. 50ng/mL의 대식세포 집락자극인자(M-CSF)를 media.
      에 추가하여 M2 유사 표현형을 위한 프라임 대식세포 메모: GM-CSF와 M-CSF는 모두 세포를 각각 M1 또는 M2에 프라이밍하면서 일반적인 대식세포 표현형(M0)에 대한 단핵구 분화를 가능하게 합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
0.5M 에다	인비트로젠	AM9260G
BD Vacutainer 플라스틱 혈액 수집 튜브(K2EDTA 포함)	BD 바이오사이언스	366643
Easy 50 EasySep 자석	스템셀 기술	18002
Easy Sep Direct 인간 단핵구 분리 키트	스템셀 기술	19669
Fetal Bovin Serum Defined Heat 비활성화	하이클론	SH30070.03안녕하세요
Nunc 35mm 세포 배양 접시	써모 사이언티픽(Thermo Scientific	150318
PBS (PBS)	지브코	20012027
페니실린-스트렙토마이신	지브코	15140122
재조합 인간 GM-CSF	R&D 시스템	215-GM-050
재조합 인간 M-CSF	R&D 시스템	제216-MC-025
RPMI 1640과 L-글루타민	코 닝	10040CVMP (영문)

년 년 )