표적 화학물질의 영향을 연구하기 위한 비만 세포 탈과립 분석

초록

출처: Tsvilovskyy, V., et al. Ca²⁺ 이미징 및 탈과립 분석을 통한 복막 유래 비만 세포의 분리 및 기능적 특성화.J. Vis. 특급 (2018).

이 동영상은 비만 세포의 탈과립 활성을 결정하기 위한 비색 분석을 보여줍니다. 비만 세포에서 방출되는 효소는 기질을 가수분해하고 착색된 생성물을 생성합니다. 비만 세포의 탈과립 활성은 세포 내 총 효소 함량으로 정규화된 세포 외부의 효소 방출 비율로 측정되었습니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 복강내 세척에 의한 PMC 분리 및 배양

1. 복강내 세척에 의한 PMC 분리
   1. 세포를 분리하기 전에 표 1에 나열된 재료를 준비합니다.
   2. PMC 분리를 위해 8주에서 14주 된 수컷 마우스를 사용하십시오. CO₂ 흡입으로 마우스를 안락사시키고 반사 상실로 인한 죽음을 확인합니다. 마우스에 70% 에탄올을 뿌리고 핀(등쪽이 아래로)을 사용하여 폼 블록에 고정합니다. 뭉툭한 가위를 사용하여 마우스의 복부 피부를 제거합니다. 복막강이 손상되지 않도록 하십시오.
      메모: 우리는 일반적으로 C57BL/6N 균주 유전적 배경을 가진 마우스에 대해 이 프로토콜을 사용합니다.
   3. 27G 바늘이 장착된 10mL 주사기를 사용하여 얼음처럼 차가운 RPMI 배지 7mL와 공기 5ml를 복강에 주입합니다. 바늘을 복막에 조심스럽게 밀어 넣고 장기에 구멍을 뚫지 마십시오. 장기 천공의 위험을 줄이기 위해 부고환 지방 부위의 반점을....

결과

그림 1: 야생형 마우스에서 분리된 PMC를 사용하여 수행된 베타-헥소사미니다아제 방출 비색 다중 웰 측정.(A) 베타-헥소사미니다아제 분석을 수행하기 위한 96웰 플레이트 피펫팅의 자극 계획; 결과는 패널 B에 제시되어 있습니다. "Spontan"은 분비물을 추가하지 않은 Tyrode의 용액을 피펫팅하는 것에 해당합니다. IM = 이오노마이신; Cp 48/80 = 화합물 48/80. (B) 표시된 농도의 이오노마이신(IM), 디니트로페놀-인간 혈청 알부민(DNP) 및 화합물 48/80(Cp 48/80)으로 자극한 후 기저 조건(Spont)에서 ß-헥소사미니다아제 방출의 백분율을 보여주는 막대 그래프. 분석은 중복으로 수행되었습니.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
RPMI 배지	써모 사이언티픽(Thermo Scientific	21875034
디피에스	시그마-알드리치	14190144
증권 시세	써모 사이언티픽(Thermo Scientific	R92157
일리노이 -3	R&D 시스템	403 밀리리터
증권 시세	써모 사이언티픽(Thermo Scientific	PMC2115
DNP-HSA(하이파이)	시그마-알드리치	A6661
안티-DNP-항체	시그마-알드리치	D-8406
펜스트렙	써모 사이언티픽(Thermo Scientific	15140122
컴파운드 48/80	시그마-알드리치	C2313
4- (1,1,3,3- 테트라 메틸 부틸) 페닐 - 폴리에틸렌 글리콜	시그마-알드리치	엑스100
4-니트로페닐 2-아세타미도-2-데옥시-β-D-글루코피라노시드	시그마-알드리치	N9376
CoverWell 이미징 챔버	시그마-알드리치	GBL635051
96웰 플레이트, V자형 바닥	코 닝	3896
96웰 플레이트, 평평한 바닥	Greiner 바이오 원	655180
"i-control" 소프트웨어가 있는 Microtiter 플레이트 리더	테칸	나노 퀀트, 인피니트 M200 프로
플랫 바닥판	Greiner 바이오 원	655180
아이오노마이신	시그마-알드리치	I9657
50 mL 플라스틱 원심분리기 튜브	사르슈테트	62.547.254
문화 플라스크 (25cm)	Greiner 바이오 원	69160
혈구계	폭스바겐	Tel.: 631-0696
단색 광원	셔터 기기	람다 DG-4
15 mL 플라스틱 원심분리기 튜브	사르슈테트	6,25,54,502
벤치 원심분리기	헤레우스	메가푸지 1.0R

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