표적 화학물질의 영향을 연구하기 위한 비만 세포 탈과립 분석

초록

출처: Tsvilovskyy, V., et al. Ca²⁺ 이미징 및 탈과립 분석을 통한 복막 유래 비만 세포의 분리 및 기능적 특성화.J. Vis. 특급 (2018).

이 동영상은 비만 세포의 탈과립 활성을 결정하기 위한 비색 분석을 보여줍니다. 비만 세포에서 방출되는 효소는 기질을 가수분해하고 착색된 생성물을 생성합니다. 비만 세포의 탈과립 활성은 세포 내 총 효소 함량으로 정규화된 세포 외부의 효소 방출 비율로 측정되었습니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 복강내 세척에 의한 PMC 분리 및 배양

1. 복강내 세척에 의한 PMC 분리
   1. 세포를 분리하기 전에 표 1에 나열된 재료를 준비합니다.
   2. PMC 분리를 위해 8주에서 14주 된 수컷 마우스를 사용하십시오. CO₂ 흡입으로 마우스를 안락사시키고 반사 상실로 인한 죽음을 확인합니다. 마우스에 70% 에탄올을 뿌리고 핀(등쪽이 아래로)을 사용하여 폼 블록에 고정합니다. 뭉툭한 가위를 사용하여 마우스의 복부 피부를 제거합니다. 복막강이 손상되지 않도록 하십시오.
      메모: 우리는 일반적으로 C57BL/6N 균주 유전적 배경을 가진 마우스에 대해 이 프로토콜을 사용합니다.
   3. 27G 바늘이 장착된 10mL 주사기를 사용하여 얼음처럼 차가운 RPMI 배지 7mL와 공기 5ml를 복강에 주입합니다. 바늘을 복막에 조심스럽게 밀어 넣고 장기에 구멍을 뚫지 마십시오. 장기 천공의 위험을 줄이기 위해 부고환 지방 부위의 반점을 사용하십시오.
   4. 주사 후 마우스를 1분 동안 흔들어 복막 세포를 RPMI 배지로 분리합니다. 내부 장기가 손상되고 복막강이 혈액으로 오염되는 것을 방지하기 위해 마우스를 너무 세게 흔들지 마십시오.
   5. 10mL 주사기에 새로운 20G 캐뉼라를 장착하여 재사용합니다. 폼 블록을 기울이고 벤치를 부드럽게 두드려 내부 장기를 한쪽으로 이동하여 다른 쪽에서 중간 흡인을 더 쉽게 할 수 있습니다. 20G 바늘을 삽입하고 베벨을 높인 다음 복부에서 나오는 액체를 부드럽고 천천히(~0.5mL/s) 흡입하여 내부 장기가 막히지 않도록 합니다. 가능한 한 많은 액체(일반적으로 5-6mL)를 수집합니다.
   6. 주사기에서 바늘을 제거하고 수집된 세포 현탁액을 얼음 위의 수집 튜브로 옮깁니다. 샘플 폐기amp혈액 오염이 보이는 경우 튜브.
   7. 세포 현탁액이 있는 튜브를 ~300 x g에서 5분 동안 원심분리합니다. 멸균 후드 아래에서 상층액을 흡입하십시오. 각 마우스에 대해 4mL의 차가운(4–10°C) PMC 배지에 샘플 펠릿을 결합하고 세포 현탁액을 25cm² 배양 플라스크로 옮깁니다. 성장 인자 IL-3 및 SCF를 각각 10ng/mL 및 30ng/mL의 최종 농도에 추가합니다. 세포가 들어있는 플라스크를 인큐베이터 (37 ° C 및 5 % CO₂)에 놓고 다음 절차까지 ~ 48 시간 동안 배양합니다.
2. PMC 문화
   1. 2일차(격리 후 ~48시간): 중간 변화
      1. 상층액 및 비부착성 세포(적혈구 및 죽은 세포)를 제거하려면 플라스크 가장자리에 파스퇴르 피펫 팁을 놓고 플라스크를 거의 수평으로 잡고 플라스크에서 배지를 흡인합니다. 마우스당 예열된 PMC 배지 4mL를 추가합니다. 성장 인자 IL-3(10ng/mL) 및 SCF(30ng/mL)를 추가합니다. 세포가 들어있는 플라스크를 인큐베이터 (37 ° C 및 5 % CO₂)에 놓습니다.
   2. 9일차: 셀 분할
      1. 세포 배양 플라스크의 세포 현탁액을 50mL 플라스틱 원심분리 튜브로 옮깁니다. 예열된(37°C) Dulbecco의 인산염 완충 식염수(DPBS) 10mL로 플라스크를 세 번 세척하고 동일한 50mL 플라스틱 원심분리 튜브에서 분리된 세포와 함께 세포 현탁액을 수집합니다. 혈구계로 세포 농도를 계산하고 총 세포 수를 계산합니다.
      2. 세포 현탁액을 ~300 x g에서 5분 동안 원심분리하고 상층액을 흡인합니다. 예열된 PMC 배지(37°C)에서 펠릿을 회수하여 세포 농도 1 x 10⁶ cells/mL를 얻습니다. 세포 현탁액을 새로운 25cm² 배양 플라스크로 옮깁니다. 섬유아세포가 바닥에 붙어 있는 오래된 플라스크는 버리십시오.
      3. 성장 인자 IL-3(10ng/mL) 및 SCF(30ng/mL)를 추가하고 세포가 들어 있는 플라스크를 인큐베이터(37°C 및 5% CO₂)에 넣습니다.
   3. 12-15일차: 세포 측정
      1. FcɛRI 수용체의 자극에 대한 실험이 계획되어 있는 경우, 표준 배양 배지에서 300ng/mL의 IgE anti-DNP로 밤새 세포를 전처리하십시오.

2. PMC의 베타-헥소사미니다제 방출 측정

1. 측정하기 전에 표 2에 나열된 재료를 준비하십시오.
   참고: MC에서 자극 후 방출되는 β-헥소사미니다아제는 p-니트로페닐-아세틸-D-글루코사민(pNAG)을 p-니트로페놀 및 N-아세틸-D-글루코사민으로 가수분해합니다. 샘플에서 β-hexosamindase의 양은 형성될 p-nitrophenol의 양에 비례합니다. "Stop Solution"의 높은 pH 환경에서 p-nitrophenol은 완전히 탈양성자화된 p-nitrophenolat로 존재하며 405nm에서 광 흡수율로 감지할 수 있습니다.
2. 130mM NaCl, 5mM KCl, 1.4mM CaCl₂, 1mM MgCl₂, 10mM HEPES, 5.6mM 포도당 및 BSA 0.1%를 함유하는 Tyrode 용액을 준비합니다. 3M NaOH로 pH를 7.4로 조정합니다.
3. Tyrode의 용액에 Triton X-100 1%를 첨가하여 용해 용액을 준비합니다.
4. 200mM 글리신으로 구성된 정지 용액을 준비하고 NaOH로 pH를 10.7로 조정합니다.
5. pNAG 용액(4-니트로페닐 2-아세타미도-2-데옥시-β-D-글루코피라노시드) 용액을 0.4M 시트르산에 pNAG를 4mM의 최종 농도로 용해시켜 준비합니다.
6. 분석에 필요한 세포의 양을 계산합니다(중복 분석 수행). 웰당 200,000개의 PMC를 사용합니다. 모든 유전자형에 대해 2웰을 음성 대조군(DNP 또는 화합물 48/80과 같은 분비물이 없는 Tyrode 용액)으로 사용하고 2웰을 양성 대조군(10μM 이오노마이신이 포함된 Tyrode 용액)으로 사용합니다.
7. 세포를 15mL 플라스틱 원심분리 튜브에 옮기고 Tyrode 용액으로 부피를 15mL로 조정한 다음 200 x g에서 4분 동안 원심분리합니다. 파스퇴르 피펫으로 상등액을 제거하고 Tyrode 용액의 세포를 2 x 10⁶ cells/mL로 재현탁합니다.
8. 웰당 100μL의 세포 현탁액을 96웰 V-바닥 웰 플레이트로 전달합니다. 각 웰에 25μL의 자극 또는 대조 용액을 추가합니다(그림 1A에 설명된 피펫팅 방식에 따름). 37 ° C 및 5 % CO₂에서 45 분 동안 세포를 배양합니다.
9. 96웰 플레이트를 얼음 위에 5분 동안 올려 반응을 멈춥니다. 그런 다음 4°C에서 120 x g에서 4분 동안 플레이트를 원심분리합니다. 멀티채널 피펫을 사용하여 120μL의 상층액을 바닥이 평평한 96웰 플레이트로 옮기고 얼음 위에 놓습니다. 세포 펠릿을 만지지 않도록 주의하되 상층액을 완전히 흡인하십시오.
10. 125μL의 용해 완충액을 세포 펠릿에 추가합니다. 세포 펠릿을 실온에서 5분 동안 배양하고 배양 후 반복적인 피펫팅(약 5회)으로 다시 현탁시킵니다.
11. pNAG 용액(4mM)의 25μL를 새로운 평평한 바닥 96웰 플레이트의 필요한 웰에 피펫팅합니다. 각 상등액에서 25μL를 준비된 pNAG 용액에 첨가하고 각 세포 용해물 25μL를 추가합니다.
12. 반응 배치를 37°C에서 1시간 동안 배양합니다. 배양 후, 반응을 중단시키기 위해 각 웰에 정지 용액 150μL를 피펫팅합니다.
13. 자동 배경 빼기를 위해 405nm에서 이중 파장 설정과 참조 630nm를 사용하여 마이크로플레이트 리더로 플레이트를 분석합니다. 획득 프로그램에서 "참조" 상자를 선택하고 "흡광도" 프로그램 요소 메뉴의 드롭다운 목록에서 "630nm"를 선택합니다. 샘플의 광학 밀도가 너무 높으면 재측정하기 전에 프로브를 적절하게 희석할 준비를 하십시오.

표 1: 1단계 재료.

개 개 개 개 개 분 세 세 세 분 분 세 의 분 세 분 분 분

1	얼음
2	10mL 주사기
3	바늘 27g
4	바늘 20g
5	스티로폼 블록 및 핀
6	수집 튜브(50mL 플라스틱 원심분리기 튜브)
7	70% 에탄올
8	RPMI Medium (사전 냉각 후 얼음에 보관)
9	PMC 배지: RPMI 배지 + 20% FCS(송아지 태아 혈청) + 1% 페니실린 스트렙토마이신 용액(Pen-Strep)
10	Dulbecco의 인산염 완충 식염수 - DPBS (Ca2+ 및 Mg2+ 제외)
11	문화 플라스크 (25cm)
12	성장 인자 원액(IL-3: 1μg/μL; SCF: 2.5 μg/mL)
13	혈청학적 피펫(10mL)
14	피펫 팁 멸균 (20–200 μL)
15	혈구계
16	벤치 원심분리기
17	가위와 집게
18	마우스용 CO2 챔버
19	개방형 멸균 후드
20	폐쇄형 멸균 후드
21	세포 배양기(37°C 및 5% CO2)
22	이송 피펫(20–200 μL)

표 2: 2단계 재료.

개 개 개 개 개 분 세 세 세 분

1	PMC(12-15일령) 1 x 106셀/mL
2	Anti-DNP-Antibody(IgE) 원액
3	DNP-HSA 스톡 솔루션
4	화합물 48/80 원액
5	아이오노마이신
6	96웰 플레이트, V자형 바닥
7	96웰 플레이트, 평평한 바닥
8	플라스틱 원심분리기 튜브(15mL)
9	혈청학적 피펫
10	세포 배양기(37°C 및 5% CO2)
11	벤치 원심분리기
12	광학 밀도 측정을 위한 Microtiter 플레이트 리더
13	멀티채널 피펫 (20–200 μL)
14	혈구계

결과

그림 1: 야생형 마우스에서 분리된 PMC를 사용하여 수행된 베타-헥소사미니다아제 방출 비색 다중 웰 측정.(A) 베타-헥소사미니다아제 분석을 수행하기 위한 96웰 플레이트 피펫팅의 자극 계획; 결과는 패널 B에 제시되어 있습니다. "Spontan"은 분비물을 추가하지 않은 Tyrode의 용액을 피펫팅하는 것에 해당합니다. IM = 이오노마이신; Cp 48/80 = 화합물 48/80. (B) 표시된 농도의 이오노마이신(IM), 디니트로페놀-인간 혈청 알부민(DNP) 및 화합물 48/80(Cp 48/80)으로 자극한 후 기저 조건(Spont)에서 ß-헥소사미니다아제 방출의 백분율을 보여주는 막대 그래프. 분석은 중복으로 수행되었습니...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
RPMI 배지	써모 사이언티픽(Thermo Scientific	21875034
디피에스	시그마-알드리치	14190144
증권 시세	써모 사이언티픽(Thermo Scientific	R92157
일리노이 -3	R&D 시스템	403 밀리리터
증권 시세	써모 사이언티픽(Thermo Scientific	PMC2115
DNP-HSA(하이파이)	시그마-알드리치	A6661
안티-DNP-항체	시그마-알드리치	D-8406
펜스트렙	써모 사이언티픽(Thermo Scientific	15140122
컴파운드 48/80	시그마-알드리치	C2313
4- (1,1,3,3- 테트라 메틸 부틸) 페닐 - 폴리에틸렌 글리콜	시그마-알드리치	엑스100
4-니트로페닐 2-아세타미도-2-데옥시-β-D-글루코피라노시드	시그마-알드리치	N9376
CoverWell 이미징 챔버	시그마-알드리치	GBL635051
96웰 플레이트, V자형 바닥	코 닝	3896
96웰 플레이트, 평평한 바닥	Greiner 바이오 원	655180
"i-control" 소프트웨어가 있는 Microtiter 플레이트 리더	테칸	나노 퀀트, 인피니트 M200 프로
플랫 바닥판	Greiner 바이오 원	655180
아이오노마이신	시그마-알드리치	I9657
50 mL 플라스틱 원심분리기 튜브	사르슈테트	62.547.254
문화 플라스크 (25cm)	Greiner 바이오 원	69160
혈구계	폭스바겐	Tel.: 631-0696
단색 광원	셔터 기기	람다 DG-4
15 mL 플라스틱 원심분리기 튜브	사르슈테트	6,25,54,502
벤치 원심분리기	헤레우스	메가푸지 1.0R

) 표시기 ) 표시기 ) ) 년 년