Mouse Kupffer 세포의 분리 및 배양

초록

출처: Bourgognon, M., et al. 나노 입자 독성 테스트를 위한 Kupffer 세포 분리. J. Vis. 특급 (2015)

이 비디오에서는 마우스 간에서 Kupffer 세포 또는 간 대식세포를 분리하는 방법을 보여줍니다. 간에는 소화 용액이 관류된 후 밀도 구배 분리가 이루어집니다. 분리된 부착 Kupffer 세포는 추가 분석에 사용할 수 있습니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 관류 및 세포 수집(그림 1)

1. 재료 표에 설명 된 모든 시약을 새로 준비하십시오.
2. EGTA(에틸렌 글리콜 테트라아세트산)/HBSS(Hank's Balanced Salt Solution) 용액(마우스당 50ml)과 콜라겐분해효소 용액(마우스당 100ml)을 40°C에서 30분 동안 데웁니다.
3. 먼저 펌프 플렉시블 튜브를 70% 에탄올로 헹굽니다. EGTA/HBSS 용액 40ml를 수조에 담근 원심분리기 튜브에 붓고 예열된 EGTA/HBSS 용액으로 펌프 플렉시블 튜브를 헹굽니다.
4. 바르비투르산염을 사용하여 말단 마취를 수행하여 호흡 억제 및 사망 전에 안정적으로 무의식 상태를 생성합니다. 페노바르비톤을 1mg/kg, ip를 여성 또는 남성 CD1 마우스(35-45g)에 주입합니다. 발가락 꼬집기로 마취를 확인합니다.
5. 복부의 털을 깎아내고 70% 에탄올 용액을 사용하여 복부 표면을 살균한다.
6. 복강을 절단하고 장을 복부 왼쪽으로 측면으로 이동하여 문맥과 하대정맥을 노출시킵니다.
7. EGTA/HBSS 용액으로 1-3ml/분의 속도로 펌프를 시작하고 23g 버터플라이 바늘(날개 절단)을 사용하여 문맥을 캐뉼레이션합니다. 23G 바늘로 캐뉼레이션된 문맥 부분을 고정한 다음 열린 마우스 복부 표면에서 세레미세 집게를 뒤집습니다. 간은 EGTA/HBSS 용액 관류 후 처음 30초 이내에 빠르게 창백해져야 합니다.
8. 간에서 과도한 압력이 형성되는 것을 방지하기 위해 하대정맥의 하부를 빠르게 절개한 다음 관류 첫 1분 동안 유속을 7ml/min으로 점차 증가시킵니다. 동물은 정맥 정맥 천자에 의한 이차적 출혈로 인해 사망합니다.
9. 원심분리기 튜브에 EGTA/HBSS 용액이 5ml 미만으로 남아 있으면 콜라겐분해효소 용액(40-50ml)을 채웁니다. 30초에 걸쳐 10ml/분으로 유속을 점진적으로 높입니다.
10. 핀셋을 사용하여 5-10초 간격으로 하대정맥에 압력을 가하여 간을 부풀게 합니다. 이것은 주기적으로(소화 중 5-10회) 수행할 수 있습니다. 이 단계는 간 세포 해리를 개선하고 콜라겐 분해 효소로 관류 시간을 단축합니다.
11. 원심분리기 튜브 내에 콜라겐분해효소 용액이 10ml 미만으로 남아 있으면 예열된 콜라겐분해효소 용액 40-50ml를 원심분리기 튜브에 붓습니다.
12. 10-15 분의 관류와 약 70-80ml의 콜라겐 분해 효소 용액을 관류한 후 겸자로 간 표면에 작은 압력을 가합니다. 압력이 인쇄되어 있으면 간 세포가 해리되었음을 나타냅니다.
13. 복강에서 간을 한 조각으로 제거하고 20-30ml의 Kupffer Cells Isolation Medium이 들어 있는 원심분리 튜브에 넣습니다. 간 세포의 생존력에 영향을 미치지 않도록 간 세포를 얼음 위 또는 4°C에서 최대 3시간 동안 유지하십시오.
14. 필요한 경우 여러 동물에 대해 관류 절차를 반복하고 관류된 간을 얼음 위에 유지합니다. 정제를 위해 1-3개의 간을 풀링하고 3단계로 진행합니다.

2. 원심분리를 위한 밀도 구배(Density Gradient) 준비(그림 2)

1. 멸균 상태에서 다음 단계(섹션 2, 3 및 5)를 진행하고 세포를 얼음 위 또는 4°C로 유지합니다. 코팅된 실리카 입자 용액 15.3ml와 10 x PBS 1.7ml를 혼합하여 SIP(Isotonic 코팅 실리카 입자 용액)를 준비합니다.
2. 20ml의 25% SIP 용액을 만들려면 SIP 5ml와 PBS 15ml를 혼합합니다. 20ml의 50% SIP 용액을 만들려면 SIP 10ml와 PBS 10ml를 혼합하십시오.
3. 원심분리기 튜브 하나에 50% SIP 용액 20ml를 채웁니다. 원심분리 튜브를 90°에 가까운 각도로 기울이고 50% SIP 층의 표면을 건드리지 않고 25ml 혈청학 피펫을 사용하여 튜브 측벽에 25% SIP 용액(20ml)을 천천히 추가합니다. 25% SIP 솔루션을 추가할 때 튜브의 각도를 점진적으로 줄이십시오. 사용할 때까지 얼음의 밀도 구배를 유지하십시오.

3. Kupffer 세포 정제(그림 3)

1. 15ml의 Kupffer Cell Isolation Medium이 있는 페트리 접시에 관류된 간 1개를 넣습니다. 가위를 사용하여 Glisson's capsule(간의 막)을 파열하고 모든 간 세포를 Kupffer 세포 분리 배지로 방출합니다. 100μm 세포 스트레이너를 통해 용액을 여과하여 원심분리 튜브에 수집합니다. 추가로 관류된 간에 관류 절차를 반복하고 동일한 원심분리 튜브에 세포를 모읍니다(마우스 1마리에서 15ml, 마우스 3마리에서 최대 45ml).
2. 세포 현탁액을 50 x g에서 4°C에서 2분 동안 원심분리합니다. 실질 세포(간세포)는 펠릿에 있고 비실질 세포(Kupffer 세포 포함)는 상층액에 있습니다.
3. 깨끗한 원심분리기 튜브에 상층액을 넣고 50 x g에서 각각 2분 동안 원심분리합니다. 이 단계를 세 번 더 반복합니다.
4. 1,350 x g에서 15분 동안 원심분리기를 사용하여 비실질 세포를 펠릿화합니다. 상등액을 버리고 펠릿을 10ml의 Kupffer Cell Isolation Medium에 재현탁합니다.
5. 2.3에 설명된 대로 불연속 isotonic gradient 25/50%에 non-parenchymal cell solution을 추가합니다. 850 x g에서 15분 동안 가속 또는 브레이크 없이 원심분리기.
6. 25/50% SIP 인터페이스에 가까운 25% SIP 분획 내에서 혼탁하게 나타나는 농축된 Kupffer 세포 분획을 국소화합니다(그림 3). 10ml 혈청학 피펫을 사용하여 약 12ml의 농축 Kupffer 세포 분획을 흡인합니다. 35-40ml의 Kupffer 세포 분리 배지가 들어 있는 원심분리 튜브로 세포를 옮깁니다. 부드럽게 혼합하고 1,350 x g에서 4°C에서 15분 동안 원심분리하여 세포를 펠릿화합니다.
7. 상등액을 버리고 5-10ml의 예열된 Kupffer 세포 배양 배지에 세포를 재현탁합니다. 세포(혈구계)를 세고 트리판 블루 염색을 사용하여 생존율을 측정합니다.
8. 정제된 비실질 세포를 5 x 10⁵ cells/well의 밀도로 24-well 플레이트에 플레이트화합니다. 37°C 및 5% CO₂에서 세포를 배양합니다(그림 3). 30분 후 배지를 부드럽게 제거하고 예열된 Hank's Balanced Salt Solution(HBSS)으로 한 번 세척한 다음 500μl의 신선하고 예열된 Kupffer 세포 배양 배지(웰당)로 교체합니다.

결과

그림 1: 간 관류. 마우스 마취 후 문맥(PV)에 접근할 수 있도록 소화관을 복부 왼쪽으로 측면으로 이동합니다. PV는 EGTA/HBSS 용액의 느린 유속(1-3ml/분)을 사용하여 캐뉼레이션되고 하부 대정맥(IVC)은 간 내의 과도한 압력을 피하기 위해 즉시 파열됩니다. 관류 후 1분 이내에 유속은 7ml/min으로 점차 증가합니다. 그런 다음 Collagenase Solution을 완전히 분해할 때까지 10ml/분으로 관류합니다.

그림 2: ...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Euthatal (펜토바르비탈 나트륨)	메리알
CD1 마우스	찰스 리버	-	마우스 무게는 35g에서 45g까지 다양해야 합니다. 체중이 급격히 증가함에 따라 수컷 CD1 마우스를 사용하는 것이 좋습니다(예: 7주 된 수컷 CD1 마우스의 체중이 35g을 초과함). 또한 나이가 많은 동물의 출산을 준비하기 위해 사전에 동물 공급업체에 연락하는 것이 좋습니다. 또는 동물이 원하는 체중에 도달하기 위해 사내에 있을 수 있습니다.
HBSS (Ca2+ 및 Mg2+ 무료, 중탄산염 포함)	생명 기술	제14175-053	HBSS는 Ca2+ 무료여야 합니다.
에틸렌 글리콜 테트라 아세트산 (EGTA) 테트라 나트륨 염	시그마-알드리치	E8145	EDTA도 사용할 수 있지만 EGTA는 Ca2+를 선택적으로 킬레이트하는 장점이 있습니다.
헤페스 (1M)	생명 기술	제15630-056	100 밀리리터
콜라겐분해효소 IV형	워 딩 턴	CSL-4	콜라겐 분해 효소의 다른 배치를 테스트하거나 적어도 제품이 간 세포 분리에 적합해야한다고 공급자에게 언급하는 것이 좋습니다
저포도당 DMEM	시그마-알드리치	D5523	500 밀리리터
RPMI(피루브산 나트륨 및 글루타맥스® 함유)	생명 기술	12633-012	500 밀리리터
페니실린/스텝토마이신	생명 기술	15140-122	100 밀리리터
소 태아 세럼	첫 번째 링크	60-00-850	500 밀리리터
Trypan 블루 솔루션	시그마-알드리치	T8154	100 밀리리터
코팅된 실리카 입자 용액(Percoll®)	GE 힐트케어	Tel.: 17-0891-02	Percoll®은 매우 안정적이며 몇 년 동안 보관할 수 있습니다
1x 인산염 완충 식염수	생명 기술	제10010-023	500 밀리리터
10x 인산염 완충 식염수	생명 기술	제70011-036	500 밀리리터
나비 혈액 채취 세트 (23G/305mm 롱 튜브)	BD (영어)	367288
실린지 필터(0.22μm 블루 림)	미니사트	16534-케이
원심분리기 튜브(50ml 블루 캡)	BD 바이오사이언스, 팔콘	35 2070
페트리 접시 (90 × 15mm)	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	BSN 101VR20
100μm 셀 스트레이너	BD (영어)	제352360
연동 펌프	왓슨 말로	사이큐 300	사용 전후에 멸균 PBS와 70% 에탄올로 튜브를 헹굽니다.
24웰 플레이트	코 닝	3526
원심 분리기	에펜도르프	5810R
Serrefine 겸자	함마허 GmbH	예술 번호 HSE 004-35 / 카탈로그 번호 221-0051	serrefine 겸자는 관류 절차 중에 겸자를 잡을 필요 없이 23G 바늘로 캐뉼레이션된 혈관을 고정할 수 있습니다. URL: (http://www.hammacher.de/Laboratory-Products/Clamps-forceps/Serrefines/HSE-004-35-Serrefine::25126.html)
셀 스크레이퍼	BD 바이오사이언스, 팔콘	353086	가위로 칼날 말단을 잘라 24웰 플레이트의 세포를 긁어냅니다.
EGTA(에틸렌 글리콜 테트라아세트산)/HBSS(행크스 밸런스드 솔트 솔루션) 용액			0.5mM EGTA 및 25mM HEPES를 함유하는 HBSS. pH를 7.4로 조정합니다. 각 간이 관류할 수 있도록 50ml를 준비합니다.
콜라겐 분해 효소 솔루션			100 UI/ml, 15 mM HEPES 및 1% 페니클린/스트렙타마이신(v/v)에서 콜라겐분해효소 IV형을 함유하는 DMEM 저포도당. pH를 7.4로 조정합니다. 각 간이 관류할 수 있도록 100ml를 준비합니다. 콜라겐 분해 효소를 첨가 한 후에는 사용하기 전에 용액을 30 분 동안 예열하는 것이 좋습니다. 이를 통해 콜라겐분해효소 활성이 최적화될 수 있습니다.
Kupffer 세포 분리 배지			RPMI는 1% 비필수 아미노산(v/v), 1% 글루타맥스®(v/v) 및 1% 페니클린/스트렙토마이신(v/v)을 함유합니다. 1-3개의 간을 위해 최소 100ml를 준비합니다.
Kupffer 세포 배양 배지			10% 소 태아 혈청, 1% 비필수 아미노산(v/v), 1% 글루타맥스®(v/v) 및 1% 페니클린/스트렙타마이신(v/v)을 함유한 RPMI. 1-3개의 간을 위해 최소 100ml를 준비합니다.
SIP (등장성 코팅 실리카 입자의 용액)			1.7ml의 10x Phosphate 완충 식염수와 15.3ml의 Percoll®을 혼합하여 17mL의 SIP를 얻습니다.
25% SIP 솔루션			SIP 5ml와 1x 인산염 완충 식염수 15ml를 혼합
50% SIP 솔루션			SIP 10ml와 1x 인산염 완충 식염수 10ml를 혼합합니다
용해 버퍼			0.9% Triton X-100을 함유한 DMEM 여과지
PBS/BSA 솔루션			1% 소 혈청 알부민으로 pH 7.4의 신선한 인산염 완충 식염수를 준비합니다.

호 호 년 년 호 호 년 ) 조 년 합니다. .