Differentiation of Human-Induced Pluripotent Stem Cells into Macrophages

초록

출처: Lopez-Yrigoyen, M., et al. 만능 줄기 세포에서 인간 대식 세포의 생산 및 특성화. J. Vis. 특급 (2020).

이 동영상은 인간 유도 만능 줄기 세포(iPSC)에서 대식세포를 생성하는 시험관 내 방법을 설명합니다. iPSC에서 대식세포 생성은 3단계로 발생합니다: (i) 현탁액에서 iPSC가 응집되어 중배엽 세포로 분화하는 3차원 배아체(EB)를 형성하고, (ii) 분화된 EB에서 대식세포 전구세포가 형성되고, (iii) 대식세포 전구세포가 성숙하고 기능적인 대식세포로 분화됩니다.

프로토콜

1. 인간 iPSC와 대식세포의 분화

참고: 대식세포 분화 프로토콜의 개략적인 요약은 그림 1에 나와 있습니다.

1. 세포 분화 성장 인자 및 기타 시약의 준비
   1. 인간 배아 줄기 세포가 없는 배지(hESC-SFM; 재료 표 참조) Dulbecco의 변형된 Eagle medium-F12(DMEM/F12)에 hESC 보충제, 1.8% w/v 소 혈청 알부민(BSA) 및 0.1mM 2-메르캅토에탄올을 보충합니다.
   2. 젤라틴을 멸균 물에 용해시켜 돼지 젤라틴의 0.1% w/v 용액을 준비합니다. 젤라틴 용액은 4°C에서 최대 2년 동안 보관할 수 있습니다.
   3. BMP4를 4mM 염화수소(HCl)-0.2% BSA PBS 용액에 용해시켜 인간 뼈 형태 유전 단백질(BMP4) 스톡 용액(25μg/mL)을 준비합니다. 원액을 cryotubes에서 50 μL 분취량으로 분배합니다. 원액은 -20°C에서 최대 1년 동안 보관할 수 있습니다. 일단 해동되면 재고 BMP4는 4 ° C에서 5 일 동안 보관할 수 있습니다.
   4. VEGF를 0.2% BSA PBS 용액에 용해시켜 인간 혈관 내피 성장 인자(VEGF) 스톡 용액(100μg/mL)을 준비합니다. 원액을 cryotubes에 10 μL 분취량으로 분배합니다. 원액은 -20°C에서 최대 1년 동안 보관할 수 있습니다. 일단 해동되면 재고 VEGF는 4 ° C에서 7 일 동안 보관할 수 있습니다.
   5. SCF를 0.2% BSA PBS 용액에 용해시켜 인간 줄기 세포 인자(SCF) 스톡 용액(100μg/mL)을 준비합니다. 원액을 cryotubes에 5 μL 분취량으로 분배합니다. 원액은 -20°C에서 최대 1년 동안 보관할 수 있습니다. 일단 해동되면 스톡 SCF는 4°C에서 10일 동안 보관할 수 있습니다.
   6. IL3를 0.2% BSA PBS 용액에 용해시켜 인간 인터루킨-3(IL3) 원액(10μg/mL)을 준비합니다. 원액을 cryotubes에 500 μL 분취량으로 분배합니다. 원액은 -20°C에서 최대 2년 동안 보관할 수 있습니다. 해동된 스톡 IL3는 4°C에서 15일 동안 보관할 수 있습니다.
   7. CSF1을 0.2% BSA PBS 용액에 용해시켜 인간 대식세포 집락자극인자(CSF1) 스톡 용액(10μg/mL)을 준비합니다. 원액을 cryotubes에 1mL 분취량으로 분배합니다. 원액은 -20°C에서 최대 2년 동안 보관할 수 있습니다. 일단 해동되면 재고 CSF1은 4 °C에서 15일 동안 보관할 수 있습니다.
2. 1단계: 배아체의 생성(0일차-3일차)
   1. 0일차에 2.25mL의 Stage 1 배지(50ng/mL BMP4, 50ng/mL VEGF 및 20ng/mL SCF가 보충된 hESC-SFM)를 초저 부착 6웰 플레이트의 웰 2개에 추가합니다.
   2. 6웰 플레이트에 있는 iPSC의 80% 융합 웰 1개의 유지보수 배지를 1.5mL의 Stage 1 배지로 교체합니다.
   3. 세포 통과 도구를 사용하여 콜로니를 절단하고 피펫으로 절단된 콜로니를 초저 부착 6웰 플레이트의 두 웰로 옮깁니다(재료 표 참조).
   4. 2일차에 0.5mL의 hESC-SFM 배지를 사용하여 사이토카인을 최종 농도인 50ng/mL BMP4, 50ng/mL VEGF 및 20ng/mL SCF로 만듭니다.
      메모: IPSC 콜로니는 EB가 됩니다(그림 2A).
3. 2단계: 현탁액에서 조혈 세포의 출현
   1. 4일차에 6웰 조직 배양 플레이트의 4웰에 0.1% w/v 젤라틴을 코팅하고 최소 10분 동안 배양합니다.
   2. 젤라틴을 제거하고 2.5mL의 Stage 2 배지(100ng/mL CSF1, 25ng/mL IL-3, 2mM 글루타맥스, 1% 페니실린-스트렙토마이신 및 0.055mM 2-메르캅토에탄올이 보충된 X-VIVO15)를 추가합니다.
   3. 형성된 EB를 50mL 원심분리기 튜브에 모아 중력에 의해 튜브 바닥에 가라앉히도록 합니다. 미디어를 조심스럽게 흡인합니다.
   4. 2기 배지 2mL에 EB를 재현탁합니다.
   5. 10–15EB(15개 이하)를 2.5mL의 Stage 2 배지가 들어 있는 젤라틴으로 코팅된 웰로 옮깁니다.
   6. 37 ° C 및 5 % CO₂ 공기에서 EB를 배양합니다.
   7. 2-3주 동안 3-4일마다 도금된 EB의 매체를 교체하십시오.
   8. 2-3주 후, EB는 비부착성 조혈 세포를 현탁액으로 방출하기 시작합니다.
      메모: 이 부유 세포 방출 기간은 다양할 수 있으며 세포주에 따라 다릅니다. 이 현탁액에 있는 세포는 수확되어 대식세포로 성숙할 수 있습니다(3단계 참조)(그림 2A).
4. 3단계: 말기 대식세포 성숙
   1. 현탁 조혈 세포를 수집하고 EB 플레이트에 배지(2단계 배지)를 보충합니다.
   2. 200 x g에서 3분 동안 원심분리기 현탁 셀.
   3. 3기 배지(100ng/mL CSF1, 2mM 글루타맥스 및 1% 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 X-VIVO15)에서 현탁 세포를 재현탁합니다.
   4. 플레이트를 수집하여 0.2 x 10⁶ cells/mL 밀도로 처리되지 않은 플라스틱 10cm 세균 등급 플레이트(10mL) 또는 코팅되지 않은 6웰 조직 배양 플레이트(3mL)에 세포를 방사했습니다.
   5. 세포를 9-11일 동안 3단계 배지에 보관하고 5일마다 배지를 교체합니다.
      메모: 3단계의 1.4.1–1.4.5단계를 3-4일마다 반복할 수 있으며, 최대 3개월 동안 기존 EB 플레이트에서 현탁 세포를 수확할 수 있습니다.

결과

그림 1: 성숙한 기능성 대식세포에 대한 iPSC 분화의 그래픽 요약. Biorender로 그린 다이어그램.

그림 2: 대식세포에 대한 iPSC 분화와 iPSC-DM 수 및 형태. (A) (왼쪽에서 오른쪽으로): IPSC 집락, 배아체(EB), 수확된 부유 세포 및 성숙한 대식세포에서 얻은 명시야 이미지. 스케일 바 = 100 μm. (B) Kwik-diff 키트로 염색된 대식세포 사이토스핀의 이미지....

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
CellMask 딥 레드 플라즈마 멤브레인 스테인	써모피셔	C10046	냉동 보존 매체
크라이오스토어 CS10	시그마	C2874
CTS CELLstart 기판	인비트로젠	A1014201	줄기세포 기질
돼지 가죽 젤라틴	시그마	G9136
재조합 인간 BMP4 단백질	R&D	314-BP-010
재조합 인간 IL3	프리프로텍	0200-03-10
재조합 인간 MCSF (캐리어 프리) 100ug	바이오레전드	574806
재조합 인간 VEGF 단백질	R&D	293-VE-010
SCF(C-Kit 리간드) 재조합 인간 단백질	써모피셔	PHC2111
스템프로 hESC SFM	써모피셔	A1000701
StemPro EZPassage 일회용 줄기 세포 패시징 도구	써모피셔	23181010
초저 부착 플레이트: 세포 배양 멀티웰 플레이트, 6웰, 셀스타 세포 발수 표면	그라이너	657970
2-메르캅토에탄올(50mM)	인비트로젠	31350010
DPBS, 칼슘, 마그네슘 (500ml)	써모피셔	14040091
글루타맥스 보충제	써모피셔	35050061