기계적 해리를 이용한 마우스 등뿌리 신경절에서 대식세포의 격리(Isolation of Macrophages from Mouse Dorsal Root Ganglion Using Mechanical Dissociation)

초록

출처: Yu, X., et al. 등뿌리 신경절 대식세포의 신속한 격리. J. Vis. 특급 (2019)

이 비디오는 기계적 해리 기술을 사용하여 쥐의 등뿌리 신경절(DRG)에서 대식세포를 분리하는 효소가 없는 프로토콜을 보여줍니다. 새로 채취한 DRG 조직의 균질화가 완료되면 대식세포의 세포 표면 수용체에 대한 항체를 사용하여 세포를 형광으로 라벨링한 다음 유세포 분석을 수행하여 샘플에 대식세포의 존재를 확인합니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

모든 동물 실험은 샌프란시스코 캘리포니아 대학의 기관 동물 보호 및 사용 위원회의 승인을 받았으며 NIH 실험실 동물 관리 및 사용 가이드에 따라 수행되었습니다.

1. 실험용 마우스에서 요추 DRG 수집

1. 실험을 시작하기 전에 9부피의 배지와 1부피의 Ca⁺⁺/Mg⁺⁺-free 10x HBSS를 혼합하여 밀도 구배 매질(예: Percoll)의 작업 용액을 준비합니다. 얼음 위에 보관하십시오.
2. 2.5% Avertin으로 마우스를 마취합니다. 뒷발 꼬집음에 대한 반응 부족으로 동물이 완전히 마취되었는지 확인하십시오.
   참고 : 6-8 주 된 수컷 및 암컷 마우스를 모두 사용했습니다.
3. 미리 냉각된 1x PBS 10mL를 마우스에 심 경으로 관류합니다.
   1. 화학 흄 후드 안에 테이프로 고정한 네 발로 마우스를 누운 자세로 놓습니다. 집게로 흉곽 아래의 피부를 들어 올리고 수술 용 가위로 작게 절개하여 간과 횡격막을 노출시킵니다.
   2. 계속해서 가위를 사용하여 횡격막과 흉곽을 자르고 흉강을 열어 박동하는 심장을 노출시킵니다.
   3. 홍채 가위로 오른쪽 심방 부속기를 빠르게 자릅니다. 출혈이 확인되면 좌심실 뒤쪽 끝에 30G 바늘을 삽입하고 미리 냉각된 1x PBS 10mL를 천천히 주입하여 동물을 관류시킵니다.
4. 엎드린 자세를 취한 마우스에 등쪽 후판 절제술을 시행합니다.
   메모: 세포 배양을 계획하고 있는 경우, 절개 전에 마우스에 70% 에탄올을 분사하고 사전 멸균된 수술 기구를 사용하여 절제합니다.
   1. 크기 11 메스를 사용하여 흉부 부위에서 시작하여 천골 부위까지 종방향 측면 깊은 절개를 하나 만듭니다. 가위로 피부를 제거하여 등쪽 근육층을 노출시킵니다.
   2. Friedman-Pearson Rongeur를 사용하여 요추 돌기와 양측 횡돌기가 드러날 때까지 결합 조직과 근육을 벗겨냅니다.
   3. Noyes Spring Scissor를 사용하여 등쪽 척추를 조심스럽게 연 다음 Friedman-Pearson Rongeur로 전환하여 척추 뼈를 제거하고 척수 신경이 손상되지 않은 척수를 노출시킵니다.
5. 동측 및 반대쪽 요추 DRG(본 연구에서는 L4/L5 DRG)를 조심스럽게 해부하고 Dounce 조직 균질화기에서 얼음처럼 차가운 Ca⁺⁺/Mg⁺⁺가 없는 1x HBSS 1mL에 넣습니다. 이제 조직은 2.
   단계를 수행할 준비가 되었습니다. 메모: 가능하면 DRG에 연결된 척추 신경을 잘라냅니다.

2. 마우스 요추 DRG에서 단일 세포 분리

1. Dounce 균질화기에서 느슨한 유봉으로 DRG 조직을 20-25회 균질화합니다.
2. 멸균 70μm 나일론 셀 스트레이너를 멸균 50mL 원뿔형 튜브에 넣습니다. 800μL의 얼음처럼 차가운 1x HBSS로 셀 스트레이너를 적시면 플로우 스루가 원뿔형 튜브에 수집됩니다.
3. 피펫을 사용하여 균질화기에서 균질화된 조직 현탁액을 수집하고 습식 70μm 나일론 세포 여과기를 통해 50mL 원뿔형 튜브에 통과시킵니다.
4. 800μL의 얼음처럼 차가운 1x HBSS로 균질기를 두 번 헹군 다음 세포 여과기가 있는 동일한 50mL 원뿔형 튜브에 디캔팅하여 수율을 높입니다.
5. 1.5mL의 평형 얼음-저온 등장성 밀도 구배 배지(1.1단계에서 준비)를 멸균 5mL 폴리스티렌 FACS 튜브에 추가합니다.
6. 50 mL 코니컬 튜브(단계 2.4)에서 세포 균질액을 FACS 튜브로 옮기고 위아래로 피펫팅하여 밀도 구배 배지와 잘 혼합합니다. 500μL의 1x HBSS를 추가하여 상단을 밀봉합니다.
7. 800 x g에서 4°C에서 20분 동안 원심분리하여 세포를 펠렛
화합니다.
8. FACS 튜브 바닥의 세포 펠릿을 방해하지 않고 배지에 myelin을 포함하는 상등액을 조심스럽게 흡인합니다.
9. FACS 분석을 위해 5% 소 태아 혈청(FBS)을 함유한 PBS 또는 FACS 완충액에 세포를 재현탁합니다.
   메모: 한 마우스의 L4/L5 DRG에서 최소 50,000 - 100,000개의 셀이 예상됩니다.
   1. 기계적으로 분리된 DRG 세포(L4/L5)를 5% 소 태아 혈청이 포함된 100μL의 PBS에 재현탁시킨 후 암흑 4°C에서 1시간 동안 α-mouse CX3CR1-APC 항체(1:2,000)로 배양합니다.
   2. PBS 5mL로 세포를 한 번 세척하고 4°C에서 8분 동안 세포를 360 x g로 원심분리합니다.
   3. 상층액을 흡입한 다음 FCAS 분석을 위해 300μL의 PBS에 세포 펠렛을 재현탁합니다. 셀 정렬이 계획된 경우 대신 FACS 버퍼에서 셀을 다시 중단합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
AP20187	클론텍	635058
a-mouse CX3CR1-APC 항체	바이오레전드	149007
아베르틴	시그마	T48402
셀 스트레이너(70mm 나일론)	송골매	352350
원심 분리기	에펜도르프	5810R
Dounce 조직 균질화기	휘튼	357538 (1ml)
FACS 튜브(5ml)	송골매	352052
프리드먼-피어슨 롱거	증권 시세	16121-14
HBSS (10배, Ca++/Mg++-free)	지브코	제14185-052
Noyes 스프링 가위	증권 시세	15012-12
퍼콜	시그마	P4937-500ml
프로피듐 요오드화물	시그마	P4864-10ml

표시기 년 호 표시기 년