동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.
1. 외과적 절제 및 조직 준비 단계:
- 소장(SI)의 외과적 제거
- CO2 질식 또는 기관 동물 윤리 위원회에서 승인한 이와 동등한 방법을 사용하여 마우스를 안락사시킵니다.
- 외과적 절제를 위해 마우스를 전용 구역으로 옮깁니다. 뒷면을 뒤집어 놓고 70% 에탄올로 복부를 소독합니다. 치골에서 흉곽까지 정중선을 따라 복부 피부와 복막을 절단하여 복막강을 열어 개복술을 수행합니다.
메모: 복막강을 관통하여 장 조직이 손상되지 않도록 피부의 비교적 작은 부위를 먼저 절개합니다. 원하는 해부학적 경계가 될 때까지 절제를 계속합니다.
- 소장의 원위 분절을 구성하는 말단 회장을 감지하기 위한 이상적인 랜드마크인 caecum을 식별합니다.
메모: Caecum은 일반적으로 쥐 복부의 왼쪽 아래에 있습니다.
- 회장 접합부를 정확히 찾아내고 소장과 회관을 분리하기 위해 가능한 한 원위부에서 이 높이를 절단합니다. 다음 단계에서는 취약한 PP는 만지면 쉽게 무너지므로 장벽에 대한 과도한 신체 접촉을 피하십시오.
- 가위를 사용하여 장간막을 잘라 유문 괄약근까지 소장 전체를 부드럽게 제거합니다. 유문과 십이지장 사이의 접합부를 확인하고 이 수준에서 십이지장을 잘라내면 복강에서 소장이 완전히 분리됩니다.
참고: (i) 과신전은 장벽의 파열을 유발할 수 있으므로 피하십시오. (ii) PP 림프구 외에 LP 림프구 분리가 필요한 경우, 장간막 지방의 완전한 제거가 필요합니다. 그러나 PP 분리의 경우에만 장간막 지방이 남아 있으면 추가 분리 단계에서 몇 가지 이점을 제공할 수 있습니다. 따라서 보존해야 합니다.
- 분리된 소장을 차가운 RPMI + 10% 소 태아 혈청(FBS)으로 채워진 6웰 플레이트에 넣고 모든 장 분절이 차가운 매체에 잠길 때까지 조직을 수동으로 부드럽게 저어줍니다. 다음 단계에서 얼음 위에 조직을 유지합니다.
- 원하는 수의 마우스 소장을 절부한 후 채취한 소장에서 PP 절제를 진행합니다.
- PP의 외과적 절제 및 단세포 현탁액의 준비:
- 집게를 사용하여 장간막 지방을 잡고 장간막 쪽을 종이 타월을 향하게 하여 종이 타월에 소장을 부드럽게 옮깁니다. 조직 탈수와 끈적임을 방지하기 위해 차가운 RPMI + 10% FBS로 전체 장 부분을 적십니다.
메모: SI의 장간막 쪽에 있는 지방 조직 분절이 종이 타월에 달라붙어 장간막 지방이 위쪽을 향하도록 유지하기 때문에 이 단계에서 도움이 될 수 있습니다.
- 장 벽의 장간막 반대쪽에서 "콜리플라워와 같은" 모양의 흰색 다엽 응집체로 나타나는 PP를 식별합니다.
메모: 모든 PP가 절제될 때까지 발광 함량을 플러시 아웃하지 않는 것이 좋습니다. 발광 내용물을 비우면 PP가 붕괴될 수 있으며 PP와 장 벽 사이의 색상 대비를 방지할 수 있어 PP의 시각적 식별에 매우 유용합니다.
- 장내 쪽에서 PP를 확인한 후 수술용 곡선 끝 가위를 PP에 올려 놓고(곡선이 위를 향해야 함) PP가 원위 및 근위 경계에서 벗어나지 않도록 합니다.
선택적: 손가락 끝을 사용하여 PP를 가위 날 쪽으로 부드럽게 밉니다. 이 조작은 주변의 비 PP 조직을 더 잘 배제하도록 이끌 것입니다. 주변 장 조직을 제외하고 PP를 부드럽게 절제합니다.
참고: (i) 이 단계는 T 세포가 풍부한 LP 및 장 상피와 같은 주변 장 구획의 세포 오염을 최소화하면서 최대 PP 세포 수율을 얻는 데 중요합니다. (ii) C57BL/6 마우스에서 절제된 하나의 SI에서 5-10 PP(평균 크기, 다엽)를 수집할 수 있습니다. 더 작은 PP(다엽이 아님)를 목표로 함으로써 이 프로토콜을 사용하여 마우스당 최대 12-13PP(C57BL/6)를 수집할 수 있습니다.
- 절제된 PP를 얼음처럼 차가운 RPMI + 10% FBS로 채우고 겸자 또는 구부러진 수술용 가위를 사용하여 얼음 위에서 유지한 12웰 조직 배양 플레이트로 옮깁니다.
참고: (i) PP 절제 직후 PP 표면의 점액 및 장 내용물은 종이 타월로 조직을 부드럽게 문질러 청소할 수 있습니다. 이 단계는 PP 림프구의 생존력을 향상시키는 데 도움이 됩니다. (ii) PP를 플레이트로 옮기는 대신, 총 샘플 수에 따라 분리된 튜브로 옮기는 것도 고려할 수 있습니다.
- 선택 사항: PP 절제 및 웰 플레이트에 후속 배치가 완료되면 PP가 포함된 조직 배양 플레이트의 사진을 찍어 다른 실험/마우스 그룹에서 수집된 PP의 수와 크기를 문서화할 수 있습니다.
- 25mL의 RPMI + 10% FBS로 채워진 50mL 원추형 튜브 세트를 준비합니다(37°C에서 예열). 가위를 사용하여 1,000mL 피펫으로 PP를 흡인할 수 있는 거리에서 1μL 팁의 가장자리를 자릅니다. 1mL 피펫으로 PP를 흡인하고 12웰 조직 배양 플레이트에서 준비된 50mL 코니컬 튜브로 옮깁니다.
메모: 각 마우스 샘플에 대해 새 팁을 사용하여 샘플 간의 교차 오염을 방지합니다.
- 뚜껑을 고정하고 튜브를 37°C의 오비탈 셰이커에 수직으로 놓고 125–150rpm에서 10분 동안 계속 교반합니다. 한편, 새로운 50mL 튜브 세트를 준비하고 각 튜브 상단에 40μm 세포 여과기를 배치하여 단일 세포 현탁액을 준비합니다.
참고: (i) 교반 단계는 제거하지 않으면 PP 림프구의 세포 생존력과 회복을 감소시키는 잔여 장 내용물, 점액 및 세포 파편을 제거합니다. (ii) 소화 과정은 세포 표면에서 CXCR5 발현의 급격한 손실을 일으키기 때문에 PP 조직에 어떤 종류의 소화 효소도 적용하지 마십시오.
- 교반 후 새로 준비된 원뿔형 50mL 튜브 상단에 놓인 40μm 세포 여과기로 PP를 옮깁니다. 10mL 주사기 플런저의 둥근 면을 사용하여 세포 여과기를 통해 PP를 부드럽게 파괴하여 단일 세포 현탁액을 생성합니다. 15–20mL의 차가운 RPMI + 10% FBS.
로 스트레이너를 헹굽니다.
알림: (i) 필터링하기 전에 PP가 들어 있는 튜브를 수평으로 흔듭니다. 이 짧은 쉐이크는 PP가 세포 스트레이너로 이동하는 것을 용이하게 합니다. (ii) 비림프구 면역 세포(예: 단핵구, 대식세포, DC)의 분리를 위해 70μm 세포 여과기를 사용하는 것이 좋습니다.
- 단일 셀 현탁액을 350–400 x g에서 4°C에서 10분 동안 원심분리합니다.
- 상층액을 조심스럽게 버리고 10 x 106 cells/mL의 농도로 세포를 재현탁합니다. 혈구계를 사용하여 세포를 세십시오.