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인간 참가자와 관련된 모든 절차는 인간 복지를 위한 제도적, 국가적, 국제적 지침에 따라 수행되었으며 지역 기관 검토 위원회의 검토를 거쳤습니다.
1. 단핵구 유래 세포의 분화 및 분극
- 단핵구 분리를 위해 플라스틱 접착을 사용하십시오. 간단히 말해서, 갓 분리한 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 적절한 농도(예: 10 x 106 PBMC)/웰 2mL 무혈청 RPMI 배지(RPMI 1640에 1mM 피루브산 나트륨, 2mM L-글루타민 및 10mM HEPES 보충))에 6-웰 배양 플레이트에 파종하고 37°C 및 5% CO2에서 배양합니다.
- 2-3시간 후, 피펫으로 비부착성 세포를 제거하고 1mL 무혈청 배지로 웰을 3회 세척합니다. 부착된 세포는 단핵구이며 웰에 첨가된 총 PBMC의 약 10%, 즉 웰당 추가된 10 x 106 PBMC에서 검색된 106 단핵구를 구성합니다.
- 대식세포 분화를 위해 M1 및 M2 대식세포 분극을 위해 각각 50ng/mL GM-CSF 또는 M-CSF를 함유한 작업 용액을 준비하고, 웰당 2mL의 RPMI 완전 배지에 첨가합니다. 37°C의 5% CO2 인큐베이터에서 3일 동안 세포를 배양합니다.
- 3일차에 각 웰의 최상층에서 세포 배양 배지 1mL를 조심스럽게 제거하고 웰에서 50ng/mL의 최종 농도를 얻기 위해 M-CSF 또는 GM-CSF의 이중 농도를 포함하는 1mL의 새로운 RPMI 완전 배지로 세포 배양액을 보충합니다. 100ng/mL/well의 사전 제작된 작업 용액에 성장 인자를 추가합니다.
- 6일차에 세포 분화의 마지막 18-20시간 동안 다른 자극을 추가하여 완전히 분극되고 성숙한 M1(인터페론-γ; IFN-γ 및 지질다당류; LPS(E. coli O55:B5)) 또는 M2(인터루킨 4; IL-4) 대식세포. M1 분극의 경우, RPMI 완전 배지(RPMI 1640에 1mM 피루브산 나트륨, 2mM L-글루타민, 10mM HEPES 및 10% 열 비활성화 소 태아 혈청(FBS)를 보충)에서 IFN-γ 및 LPS를 준비하고 웰당 50μL를 추가하여 세포 배양에서 50ng/mL IFN-γ 및 10ng/mL LPS의 최종 농도를 얻습니다. M2 분극의 경우 RPMI 완전 배지에서 IL-4를 준비하고 웰당 50μL를 추가하여 세포 배양에서 20ng/mL의 최종 농도를 얻습니다.
- M0 편광 대식세포의 분화를 위해 추가 사이토카인(M2 유사 표현형 제공) 없이 M-CSF만으로 세포를 자극합니다.
- 광학 현미경으로 단핵구 유래 세포 배양의 형태를 정기적으로 확인하여 작은 단핵구가 더 큰 대식세포 유사 세포로 분화되었는지 확인합니다. 또한 M1 및 M2 편광 사이의 잠재적인 형태학적 차이, 즉 더 둥근 모양의 M2 세포와 비교하여 길쭉하고 늘어난 M1 세포를 모니터링합니다.