Differentiation and Polarization of Monocyte-Derived Cells into Macrophage-Like Cells

초록

출처: Mily, A., et al. M1 및 M2 인간 단핵구 유래 세포의 분극 및 Mycobacterium tuberculosis 감염 시 유세포 분석을 사용한 분석. J. Vis. 특급 (2020).

이 비디오에서는 말초 혈액 유래 단핵구를 M1 또는 M2 대식세포로 분화 및 분극을 유도하는 절차를 보여줍니다. 과립구-대식세포 집락자극인자, 지질다당류, 인터페론-감마를 이용한 배양은 전염증성 M1 대식세포를 생성하고, 대식세포 집락자극인자와 인터루킨-4를 사용한 배양은 항염증성 M2 대식세포 생산을 유도합니다.

프로토콜

인간 참가자와 관련된 모든 절차는 인간 복지를 위한 제도적, 국가적, 국제적 지침에 따라 수행되었으며 지역 기관 검토 위원회의 검토를 거쳤습니다.

1. 단핵구 유래 세포의 분화 및 분극

1. 단핵구 분리를 위해 플라스틱 접착을 사용하십시오. 간단히 말해서, 갓 분리한 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 적절한 농도(예: 10 x 10⁶ PBMC)/웰 2mL 무혈청 RPMI 배지(RPMI 1640에 1mM 피루브산 나트륨, 2mM L-글루타민 및 10mM HEPES 보충))에 6-웰 배양 플레이트에 파종하고 37°C 및 5% CO₂에서 배양합니다.
2. 2-3시간 후, 피펫으로 비부착성 세포를 제거하고 1mL 무혈청 배지로 웰을 3회 세척합니다. 부착된 세포는 단핵구이며 웰에 첨가된 총 PBMC의 약 10%, 즉 웰당 추가된 10 x 10⁶ PBMC에서 검색된 10⁶ 단핵구를 구성합니다.
3. 대식세포 분화를 위해 M1 및 M2 대식세포 분극을 위해 각각 50ng/mL GM-CSF 또는 M-CSF를 함유한 작업 용액을 준비하고, 웰당 2mL의 RPMI 완전 배지에 첨가합니다. 37°C의 5% CO₂ 인큐베이터에서 3일 동안 세포를 배양합니다.
4. 3일차에 각 웰의 최상층에서 세포 배양 배지 1mL를 조심스럽게 제거하고 웰에서 50ng/mL의 최종 농도를 얻기 위해 M-CSF 또는 GM-CSF의 이중 농도를 포함하는 1mL의 새로운 RPMI 완전 배지로 세포 배양액을 보충합니다. 100ng/mL/well의 사전 제작된 작업 용액에 성장 인자를 추가합니다.
5. 6일차에 세포 분화의 마지막 18-20시간 동안 다른 자극을 추가하여 완전히 분극되고 성숙한 M1(인터페론-γ; IFN-γ 및 지질다당류; LPS(E. coli O55:B5)) 또는 M2(인터루킨 4; IL-4) 대식세포. M1 분극의 경우, RPMI 완전 배지(RPMI 1640에 1mM 피루브산 나트륨, 2mM L-글루타민, 10mM HEPES 및 10% 열 비활성화 소 태아 혈청(FBS)를 보충)에서 IFN-γ 및 LPS를 준비하고 웰당 50μL를 추가하여 세포 배양에서 50ng/mL IFN-γ 및 10ng/mL LPS의 최종 농도를 얻습니다. M2 분극의 경우 RPMI 완전 배지에서 IL-4를 준비하고 웰당 50μL를 추가하여 세포 배양에서 20ng/mL의 최종 농도를 얻습니다.
6. M0 편광 대식세포의 분화를 위해 추가 사이토카인(M2 유사 표현형 제공) 없이 M-CSF만으로 세포를 자극합니다.
7. 광학 현미경으로 단핵구 유래 세포 배양의 형태를 정기적으로 확인하여 작은 단핵구가 더 큰 대식세포 유사 세포로 분화되었는지 확인합니다. 또한 M1 및 M2 편광 사이의 잠재적인 형태학적 차이, 즉 더 둥근 모양의 M2 세포와 비교하여 길쭉하고 늘어난 M1 세포를 모니터링합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Falcon 6웰 플랫 바텀 플레이트	코닝 생명과학	353046
GM-CSF	페프로텍	300-03
IFN-γ	페프로텍	300-02
일리노이 -4	페프로텍	200-04
L-글루타민	GE 헬스케어 생명과학	SH30034.01
M-CSF	페프로텍	300-25
RPMI 1640	생명 기술 공사	SH30096.01
소 태아 혈청(FBS)	시그마-알드리치	F7524
헤페스	GE 헬스케어 생명과학	SH30237.01
LPS(대장균 O55:B5)	시그마-알드리치	L6529
나-피루브산	GE 헬스케어 생명과학	SH300239.01

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