방법 논문

In vitro Generation of Plasmacytoid Dendritic Cells from Common Lymphoid Progenitors(일반 림프구 전구 세포에서 Plasmacytoid 수지상 세포의 체외 생성)

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2025년 7월 8일

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초록

출처: Chang, S., et al. AC-6 피더 시스템을 사용하여 일반적인 림프구 전구 세포에서 쥐 plasmacytoid 수지상 세포의 체외 생성. J. Vis. 특급 (2015년)

이 동영상은 일반적인 림프구 전구 세포(CLP)에서 형질세포(plasmacytoid dendritic cell, pDC)를 생성하는 체외 분석을 보여줍니다. Fms-like tyrosine kinase-3 ligand(FL)가 있는 상태에서 γ조사된 공급 세포와 함께 정제된 CLP를 공동 배양하면 CLP는 비부착성 pDC로 분화되며, 유세포 분석을 사용하여 그 존재를 확인합니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. AC-6 피더 셀의 준비

참고: AC-6.21(줄여서 AC-6) 기질 세포주(스탠포드 대학의 I. Weissman 제공)는 15% 열 비활성화 소 태아 혈청(FBS)이 보충된 RPMI로 유지되어야 합니다. 공급세포(feeder cell) 역할을 하기 위해 AC-6 세포는 증식을 방지하기 위해 공동 배양 하루 전에 3,000 rad(30Gy)를 γ 조사합니다. AC-6 세포는 유지 관리 중에 과밀하게 방치되거나 통과 수가 20 이상인 경우 분화 지원 능력을 잃는 경향이 있습니다.

  1. AC-6 세포를 1ml Dulbecco의 인산염 완충 식염수(DPBS)로 한 번 세척하고 흡인으로 DPBS를 제거합니다. AC-6 세포를 0.8ml 트립신 용액(DPBS의 0.05% 트립신 및 0.5mM EDTA)으로 37°C, 5% CO2에서 3-5분 동안 처리한 다음 10부피의 배양 배지로 희석하여 반응을 중지하여 단일 세포 현탁액을 만듭니다.
  2. AC-6 세포를 5.9x104 cells/well에서 12-well plate에 시딩하고 37oC, 5% CO2 O/N.
    에서 배양합니다. 메모: AC-6 셀의 밀도는 밀도가 낮을수록 cDC 발생에 유리하기 때문에 매우 중요합니다. 5.9x104 cells/well의 밀도에서 파종하면 AC-6이 다음 날까지 합류점에 도달할 수 있으며, 이는 CLP에서 pDC를 유도하는 데 최적입니다.
  3. γ-irradiator.
    를 사용하여 3,000rad(30Gy)에서 AC-6 세포를 조사합니다. 참고: AC-6를 조사하는 데 사용되는 선량은 세포가 증식하는 것을 방지하면서도 CLP에서 DC를 구별하는 데 필요한 사이토카인 및 세포-세포 접촉을 제공할 수 있을 만큼 충분히 오래 생존할 수 있도록 최적화되어 있습니다.
  4. 배지를 흡입하고 1ml의 완전한 RPMI(10% 열 비활성화 FBS, 50μg/ml 겐타마이신 및 50μM β-메르캅토에탄올이 포함된 RPMI)로 교체합니다.

2. 마우스에서 BM 세포 분리

  1. CO2 질식 및 자궁 경부 탈구로 마우스를 희생시킵니다. 생쥐를 해부 트레이에 놓고 70% 에탄올로 살균합니다. 복부 중간을 절개하고 하지를 덮는 피부를 포함하여 마우스의 원위부에서 피부를 제거합니다.
  2. 반 멸균 후드에서 마우스를 해부합니다. 대퇴골과 경골을 분리하려면 대퇴골을 위쪽으로, 경골을 무릎 관절 아래에 클립합니다. 가위를 사용하여 뼈에서 근육을 분리하고 5ml의 완전한 RPMI가 들어 있는 6cm 페트리 접시에 뼈를 넣습니다.
  3. 멸균 배양 후드로 이동합니다. 27G 바늘에 연결된 3ml 주사기에 완전한 RPMI를 채웁니다. 뼈의 양쪽 끝을 가위로 잘라내고, 27G 바늘을 꽂아 양쪽 끝에서 한 번씩 RPMI를 부드럽게 주입하여 뼈에서 골수를 씻어냅니다.
  4. 바늘 없이 주사기를 사용하여 배양 접시에서 세포를 3-5회 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 단일 세포 현탁액을 준비합니다.
  5. 500 x g에서 5분 동안 세포를 원심분리하고 상층액을 디캔팅합니다.
  6. 적혈구를 1ml ACK 완충액(150mM NH4Cl, 10mM KHCO3, 0.1mM EDTA)으로 1분 동안 배양하고 10부피의 완전한 RPMI로 희석하여 반응을 중단합니다. 중력에 의해 죽은 세포 덩어리와 조직 파편을 펠릿으로 만들기 위해 세포를 5분 동안 서 있게 합니다.
    메모: 생존 가능한 세포의 침전으로 인해 세포 손실이 발생하므로 5분 이상 서 있지 마십시오.
  7. 세포가 함유된 상층액을 새 튜브로 천천히 디캔트하여 원래 튜브에 파편을 남깁니다.
  8. 500 x g에서 5분 동안 원심분리기를 사용하여 세포를 펠릿화한 다음 상층액을 제거하고 폐기합니다.
  9. 100μl FACS 버퍼(1x PBS+ 2% FBS+ 1mM EDTA)에서 총 BM 세포(일반적으로 4-6 x 10,7 BM 세포는 1마리의 마우스에서 획득됨)를 재현탁합니다.

3. CLP의 FACS 분석 및 정렬

  1. Fc 수용체를 차단하기 위해 항-CD16/32(하이브리도마 상층 클론 2.4G2, 50 μl/반응 또는 1-2 μg/반응)를 1-2분 동안 FACS 완충액(단계 2.9)의 세포에 추가합니다.
    메모: Anti-CD16/32는 Fc block이라고도 하며, 과립구, 단핵구, B 림프구를 포함한 Fc 수용체를 발현하는 세포에 항체가 비특이적으로 결합하는 것을 방지하기 위해 추가됩니다.
  2. 동시에 주변 조명을 피하고 얼음 위에서 다음 형광 염료 표지 항체(4x107개 세포의 경우)로 세포를 15분 동안 염색합니다. 항체: PE-conjugated lineage markers (0.0.) 항-CD3(17A2), 항-CD8(53-6.7), 항-B220(RA3-6B2), 항-CD19(eBio1D3), 항-CD11b(M1/70), 항-Gr-1(RB6-8C5), 항-Thy1.1(HIS51), 항-NK1.1(PK136), 항-TER119(TER-119) 및 항-MHC-II(NIMR-4), 0.2μg 항-c-Kit-PerCP-Cy5.5(2B8), 1μg 항-Sca-1-FITC(D7), 0.4μg 항-M-CSFR-APC(AFS98) 및 0.2μg 항-IL-7Rα-PE-Cy7(A7R34).
  3. 3ml FACS 버퍼로 셀을 세척하고 500 x g에서 5분 동안 원심분리합니다.
  4. 300μl FACS 완충액에 세포를 재현탁하고 40μM 세포 스트레이너를 통해 세포를 필터링합니다.
  5. 추가 100μl FACS 버퍼로 튜브를 세척하여 남아 있는 세포를 회수하고 동일한 세포 스트레이너를 사용하여 멸균 FACS 분류 튜브로 여과합니다.
  6. 신호 검출을 위해 적절한 필터와 전압을 사용하여 염색 직후 유세포 분석을 수행합니다. 488nm 레이저를 사용하여 FITC-, PerCP-Cy5.5 표지 항체를 검출하고, 561nm 레이저를 사용하여 PE 및 PE-Cy7 표지 항체를 검출하고, 633nm 레이저를 사용하여 APC 표지 항체를 검출합니다.
  7. 세포 분류기를 사용하여 lin-c-kit intSca-1intM-CSFR-IL-7Rα+ (3.2단계에서 염색된 것과 같이) 마커에 따라 CLP를 분류합니다. 분류된 세포를 8ml의 완전한 RPMI가 포함된 15ml 튜브에 쿠션으로 수집합니다.
  8. 실행이 끝날 때 셀 분류기에 표시된 대로 정렬된 셀의 절대 수를 기록합니다. 일반적으로 5x104 CLP는 한 마우스의 BM에서 얻을 수 있습니다.

4. 공동 문화 CLP 및 AC-6

  1. 3.7단계에서 분류된 세포를 500 x g에서 10분 동안 원심분리하고, 상층액을 제거하고, 약 5x104 cells/ml의 세포 밀도를 얻을 수 있도록 충분한 완전한 RPMI로 세포 펠릿을 재현탁합니다. 1.4단계에서 준비한 공급세포를 포함하는 12웰 플레이트에 500개의 세포/웰을 시딩합니다.
  2. 100ng/ml FL(스위스 취리히 대학병원의 M. Manz에서 제공한 발현 시스템을 사용하여 사내에서 생성)을 추가하고 현미경으로 DC 발달을 주기적으로 육안으로 모니터링하면서 37oC, 5% CO2에서 배양합니다.
    메모: 시판되는 재조합 human FL 또는 mouse FL은 DC 개발을 지원하기 위해 hu-Flt3L-Ig의 대체품으로 사용할 수 있습니다.
  3. 12일째에 상층액에서 세포를 수집하고 생성된 상등액을 결합한 0.5ml의 완전한 RPMI 배지로 웰을 한 번 세척합니다. 0.5ml의 새로운 배지를 추가하고 세포 스크레이퍼로 부착 세포를 스크랩합니다.
  4. 두 부분의 세포 함유 배지를 결합하고 500 x g에서 5분 동안 원심분리합니다.
  5. 50 μl FACS 완충액에 상층액을 디캔트 및 재현탁액 세포. 50 μl 항-CD16/32 하이브리도마 상층액을 첨가하고 1-2분 동안 배양하여 Fc 수용체를 차단합니다.
  6. 항-CD11c-APC(N418), 항-CD11b-FITC 및 항-B220-PE 항체(각 0.05μg)로 모든 세포를 열거하고 염색합니다.
  7. 3.3단계에서 설명한 대로 세포를 세척하고 원심분리합니다.
  8. 100μl FACS 버퍼에서 세포를 재현탁하고 CD11c+에서 게이트를 수행하며 cDC(CD11c+CD11b+B220-) 및 pDC(CD11c+CD11b-B220+)를 분석합니다.

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공개 사항

선언된 이해 상충이 없습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
안티 마우스 Ly6g / Ly6c (PE), 클론 RB6-8C5바이오레전드108408리니지 마커
안티 마우스 NK1.1 (PE), 클론 PK136바이오레전드108708리니지 마커
안티 마우스 CD11b(PE), 클론M1/70바이오레전드101208리니지 마커
안티 마우스 CD19(PE), 클론 eBio1D3바이오레전드115508리니지 마커
안티 마우스 B220 (PE), 클론 RA3-6B2바이오레전드103208리니지 마커/FACS
안티 마우스 CD3 (PE), 클론 17A2바이오레전드100308리니지 마커
안티 마우스 CD8a (PE), 클론 53-6.7바이오레전드100707리니지 마커
안티 마우스 MHC-II(PE), 클론 NIMR-4바이오레전드107608리니지 마커
안티 마우스 Ter119 (PE), 클론 TER-119바이오레전드116208리니지 마커
안티 마우스 Thy1.1 (PE), 클론 HIS51이바이오사이언스Tel.: 12-0900-83리니지 마커
안티 마우스 M-CSFR (APC), 클론 AFS98바이오레전드135510팩스
안티 마우스 c-Kit(PerCP/Cy5.5), 클론 2B8바이오레전드105824팩스
안티 마우스 Sca-1 (FITC), 클론 D7바이오레전드108106팩스
안티 마우스 IL-7Ra (PE / Cy7), 클론 A7R34바이오레전드135014팩스
안티 마우스 CD11c(PerCP/Cy5.5), 클론 N418바이오레전드117328팩스
안티 마우스 CD11b (FITC), 클론 M1/70바이오레전드101206팩스
FACS리아 IIIBD 바이오사이언스셀 분류기
FACS 선별 튜브BD 바이오사이언스352054
플로우조플로우조 LLC흐름 분석 소프트웨어
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