단핵구에서 미성숙, 성숙 및 톨러겐 수지상 세포 생성

초록

출처: Sim, W. J. et al., 대사 표현형이 다른 미성숙하고 성숙한 및 톨레로겐 수지상 세포의 생성.J. Vis. 특급(2016).

이 비디오는 인간 단핵구에서 미성숙, 성숙 및 내성 수지상 세포(DC)의 생성을 보여줍니다. 성장 인자와 사이토카인을 가진 단핵구의 배양은 미성숙 DC의 생산으로 이어집니다. 면역 조절 분자에 대한 반응으로 미성숙 DC는 내성 및 성숙 DC로 분화합니다.

프로토콜

인간 참가자와 관련된 모든 절차는 인간 복지를 위한 제도적, 국가적, 국제적 지침에 따라 수행되었으며 지역 기관 검토 위원회의 검토를 거쳤습니다.

1. 말초혈액 단핵세포(PBMC)의 분리

1. 시약의 준비
   1. PBS/EDTA: 인산염 완충 식염수(PBS)를 준비하고 2mM 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)을 보충합니다. 이 용액은 0.2μm 필터를 통한 여과로 멸균합니다. 참고: PBS/EDTA는 4°C에서 보관하고 사용하기 전에 실온으로 데우십시오.
   2. 염색 완충액 준비: 인산염 완충 식염수(PBS) 보충제에 2% 소 태아 혈청(FBS), 10mM 4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산(HEPES) 및 2mM 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA). 이 용액은 0.2μm 필터를 통한 여과로 멸균합니다.
2. 블러드 콘에서 혈액 채취
   메모: 혈구에는 병원에서 혈소판 채취 후 채취한 백혈구 성분이 포함되어 있습니다. 헤파린 또는 EDTA 튜브에 혈액이 채취된 경우 PBS로 혈액을 1:1 비율로 희석하고 1.3단계로 진행합니다. 버피 코트를 받으면 PBS가 함유된 버피 코트를 1:2 비율로 희석하고 1.3단계로 진행합니다.
   1. 혈액이 50ml 튜브로 흘러 나오도록 원뿔의 양쪽 끝을 자릅니다.
      원뿔에는 일반적으로 10ml의 혈액이 들어 있습니다.
   2. PBS/EDTA 30ml가 함유된 뭉툭한 주사기를 사용하여 콘을 세척하고 50ml 튜브에 모읍니다.
   3. PBS/EDTA로 혈액을 최종 부피 80ml로 더 희석합니다.
3. 밀도 원심분리에 의한 PBMC 분리
   1. 15ml Ficoll을 각각 4개의 신선한 50ml 튜브에 분주합니다.
   2. 25ml의 혈청학적 피펫을 사용하여 Ficoll 층에 희석된 혈액 20ml를 추가합니다. 50ml 튜브를 45도 각도로 잡고 계간을 방해하지 않도록 주의하십시오.
   3. 브레이크 없이 805 x g에서 튜브를 30분, 20°C 동안 원심분리합니다.
   4. 플라즈마 층을 제거하고 파스퇴르 피펫으로 플라즈마 층 바로 아래에있는 PBMC의 고리를 수집합니다. PBMC 튜브 4개를 50ml 튜브 2개로 결합합니다. PBMC 아래의 투명 층을 수집하지 않도록 주의하십시오.
   5. PBMC 튜브당 50ml의 최종 부피에 PBS/EDTA를 추가하고 브레이크를 사용하여 548 x g에서 20°C, 10분 동안 원심분리합니다.
   6. 상층액을 흡입하고 25ml의 염색 완충액으로 각 튜브에 펠릿을 재현탁시키고 하나의 50ml 튜브로 결합합니다.
   7. 367 x g의 원심분리기, 5분, 4°C 브레이크 포함.
   8. 상층액을 흡입하고 10ml의 염색 완충액으로 펠릿을 재현탁합니다.

2. 자기 분리에 의한 단핵구 농축

1. 셀 번호 확인
   1. PBMC 세포 현탁액 20μl를 20μl의 트리판 블루와 혼합하여 세포분석기를 사용하여 살아있는 세포의 수를 계산합니다.
   2. 원심분리기 셀 서스펜션, 367 x g, 10분, 4°C 브레이크 포함.
   3. 상층액을 완전히 흡인하고 세포 펠렛을 염색 완충액 80μl당 10⁷ 세포의 농도로 재현탁합니다.
2. 마그네틱 라벨링
   1. 10⁷ cells당 20 μl의 CD14 microbeads를 첨가하고 잘 혼합한 후 2 - 8 °C에서 15분 동안 배양합니다.
   2. 10⁷ 셀당 1ml의 염색 완충액을 첨가하여 셀을 세척하고 367 x g에서 브레이크를 사용하여 10분, 4°C 동안 원심분리합니다.
   3. 상층액을 완전히 흡인하고 염색 완충액 50μl당 10⁷ 세포 농도로 세포 펠렛을 재현탁합니다.
3. 자기 분리
   1. 최대 2 x 10^{총 8}개의 셀에 중간 크기의 열을 사용합니다.
      메모: 전체 셀의 수와 데이터시트에서 권장하는 CD14⁺ 셀의 수에 따라 적절한 열과 구분 기호를 선택합니다.
   2. 적절한 분리기의 자기장에 컬럼을 배치하고 500μl의 염색 완충액으로 헹궈 컬럼을 준비합니다.
   3. 세포 현탁액을 컬럼에 피펫팅하고 15ml 튜브로 컬럼을 통과하는 라벨링되지 않은 세포를 수집합니다.
   4. 컬럼 아래에 새 15ml 튜브를 교체하고 500μl의 염색 버퍼로 컬럼을 3회 세척합니다. 세척 사이에 새 염색 완충액을 추가하기 전에 컬럼 저장소가 비어 있는지 확인하십시오.
   5. 분리기에서 컬럼을 제거하고 새 15ml 튜브에 놓습니다.
   6. 얼룩 완충액 1ml를 컬럼에 피펫으로 싣습니다. 플런저(키트에 제공됨)를 컬럼 안으로 단단히 밀어 자기적으로 라벨링된 셀을 즉시 씻어냅니다.
   7. 새 컬럼에서 용출된 분획을 사용하여 2.3.2-2.3.6단계를 반복하여 CD14+ 세포의 순도를 높입니다. 비드는 3.2단계 동안 배양 중 세포에서 자동으로 방출됩니다.

3. 수지상 세포의 다른 활성화 상태에 대한 분화

1. 시약 준비(모든 시약에서 내독소 수치가 0.1 EU/ml 미만이어야 함)
   1. 세포 배양 배지 준비: 10% 소 태아 혈청(FBS), 1% 비필수 아미노산(NEAA) 및 0.05mM 2-메르캅토에탄올(2ME)이 보충된 RPMI 1640. 이 용액은 0.2μm 필터를 통한 여과로 멸균합니다.
   2. 사이토카인 준비: 무균 조건에서 세포 배양 등급 물에서 IL-4 및 GM-CSF를 각각 0.25mg/ml의 농도로 재구성합니다. 사이토카인을 200μl 마이크로 원심분리기 튜브에 분취하고 -80°C에서 보관합니다.
   3. 비타민 D3 스톡을 준비합니다: 무균 조건에서 세포 배양 등급의 물에서 비타민 D3를 100mM의 농도로 재구성합니다. 비타민 D3를 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브에 넣고 -20°C에서 보관합니다.
   4. 덱사메타손 스톡을 준비합니다: 무균 조건에서 세포 배양 등급 물에서 덱사메타손을 10mM 농도로 재구성합니다. 디사메타손을 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브에 분취하고 -20°C에서 보관합니다.
   5. LPS 준비: 무균 조건에서 세포 배양 등급 물에서 지질다당류(LPS)를 1mg/ml의 농도로 재구성합니다. LPS를 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브에 분취하고 -20°C에서 보관합니다.
2. 다양한 moDC 생성
   1. 6 웰 플레이트에 200ng/ml의 GM-CSF와 200ng/ml의 IL-4가 보충된 0.3 - 0.5 x 10⁶/ml 세포 배양 배지의 농도로 CD14⁺ 단핵구 4세트를 시드합니다. 이것은 Day 0이고 각 6웰의 배지 부피는 2ml입니다.
   2. 조직 배양 인큐베이터에서 37°C에서 5% CO₂로 세포를 배양합니다.
   3. 4일차에 배양액에서 배지 850μl를 제거하고 300 x g에서 4°C, 5분 동안 원심분리합니다.상층액을 흡입하고 2x(GM-CSF 200ng/ml 및 IL-4 200ng/ml)를 함유한 세포 배양 배지 1ml에 펠렛을 재현탁합니다. 이 세포 혼합물을 배양액에 다시 첨가합니다. GM-CSF 및 IL-4에 대해 첨가된 2x 농도는 1ml의 배지를 배양액에 다시 첨가할 때 1x가 됩니다.
   4. 5일차에 배지 ml 당 1μl의 비타민 D3 스톡과 1μl의 덱사메타손 스톡을 2세트에 추가하여 내성 moDC를 생성합니다. 비타민 D3의 최종 농도는 100nM이고 덱사메타손은 10nM입니다. 5일차에는 GM-CSF와 IL-4를 추가할 필요가 없습니다.
   5. 6일차에 GM-CSF 200ng/ml와 IL-4 200ng/ml를 모든 세트에 추가합니다.
   6. 6일차에 GM-CSF 및 IL-4만 처리한 세트 중 하나에 1μg/ml의 LPS를 추가하여 성숙한 moDC를 생성합니다.
   7. 6일차에 1μg/ml의 LPS를 1세트의 tolerogenic moDC에 추가하여 LPS 내성 moDC를 생성합니다.
   8. 유세포 분석 또는 기타 연구를 위해 PBS, EDTA로 배양 접시를 세척하여 7일차에 다양한 유형의 moDC를 수확합니다. 비부착성 세포만 수확됩니다. 미성숙 moDC, 성숙 moDC, 내성 moDC 및 LPS 내성 DC에 대한 CD14⁺ 단핵구의 수율 비율은 각각 약 90%, 50%, 60% 및 60%이며 헌혈자와 FBS lot에 따라 다릅니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
피콜	GE 헬스케어	Tel.: 17-1440-03	PBMC 절연
주사기	Becton, 디킨슨	302832	PBMC 절연
1.5mL 원심분리기 튜브	액시겐	MCT-150-C	PBMC 절연
15 mL 팔콘 튜브	송골매	352096	PBMC 절연
50 mL 팔콘 튜브	송골매	352070	PBMC 절연
원심 분리기	에펜도르프	5810R	PBMC 절연
0.2 μm 필터	싸토리우스 스테딤 바이오텍	17597	PBMC 절연
MAC 키트	밀테니 바이오텍	Tel.: 130-042-201	단핵구 농축
MiniMACS 분리기	밀테니 바이오텍	Tel.: 130-042-102	단핵구 농축
세포 배양 등급의 물	Invitrogen, 생명 기술		세포 배양
RPMI	Gibco, 라이프 테크놀로지스	11875-093	세포 배양
FBS(증권 시세	하이클론	SH30070103	세포 배양
페니실린-스트렙토마이신	Gibco, 라이프 테크놀로지스	15140	세포 배양
인산염 완충 식염수	Gibco, 라이프 테크놀로지스	제10010-031	세포 배양
네아	Gibco, 라이프 테크놀로지스	제11140-040	세포 배양
에디타	Gibco, 라이프 테크놀로지스	15575	세포 배양
헤페스	Gibco, 라이프 테크놀로지스	제15630-080	세포 배양
나트륨 피루브산	Gibco, 라이프 테크놀로지스	제11360-070	세포 배양
GM-CSF	밀테니 바이오텍	Tel.: 130-093-868	세포 배양
일리노이 -4	밀테니 바이오텍	Tel.: 130-093-924	세포 배양
비타민 D3	시그마	D1530	세포 배양
덱사메타손	시그마	D2915	세포 배양
증권 시세	시그마	엘2755	세포 배양
트리판 블루	Gibco, 라이프 테크놀로지스	제15250-061	세포 배양

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