인간 말초 혈액에서 B 세포의 분리 및 정제

초록

출처: Tzeng, S. J. 혈액에서 인간 항체 분비 B 세포의 분리, 분화 및 정량화: 체액 면역의 기능적 판독으로서의 ELISpot. J. Vis. 특급. (2016년)

이 동영상에서는 non-B 세포 및 스트렙타비딘 접합 자성 마이크로비드에 특이적인 비오틴화 항체를 사용하여 인간 말초 혈액에서 B 세포를 분리하는 방법을 보여줍니다.

프로토콜

인간 참가자와 관련된 모든 절차는 인간 복지를 위한 기관, 국가 및 국제 지침에 따라 수행되었으며 지역 기관 검토 위원회의 검토를 거쳤습니다.

1. 인간 말초 혈액 B 세포의 분리 및 정제

1. 정중 큐비탈 정맥(팔꿈치 앞쪽의 큐비탈 포사)에서 ~ 10mL의 혈액을 K₂EDTA(1.5 - 2.0 mg/mL 혈액)가 들어 있는 15mL 튜브에 넣고 즉시 튜브를 여러 번 뒤집어 혈전 형성을 방지합니다.
2. 신선한 혈액 샘플(≥ 3:1 vol/vol)이 들어 있는 튜브에 오토클레이브(121°C, 15분) 적혈구(RBC) 용해 완충액(150mM NH₄Cl, 10mM KHCO₃ 및 1mM EDTA, pH 7.4)을 35mL 추가하고 실온(RT)에서 5분 이상 배양하지 않습니다.
   메모: 튜브를 통한 광 투과가 나타나면 적혈구 용해가 완료되었음을 나타냅니다.
3. 600 x g에서 상온에서 5분 동안 원심분리기 펠릿이 흰색인지 확인합니다.
4. 10mL의 오토클레이브 인산염 완충 식염수(PBS, 137mM NaCl, 2.7mM KCl, 4.3mM Na₂HPO₄ 및 1.47mM KH₂PO₄, pH 7.4)와 1.3단계와 같이 원심분리로 펠릿을 재현
탁합니다.
5. 상등액을 버리고 RPMI 1640 배지 10mL(보충제: 10% 태아 송아지 혈청, 100U/mL 페니실린/스트렙토마이신, 0.25μg/mL 암포테리신 B 및 2mM L-글루타민)로 펠릿을 재현탁한 다음 세포를 10cm 배양 접시(접시당 혈액 10mL)에 플레이트합니다. 접시를 37% CO₅의 2°C 인큐베이터에 30분 동안 놓습니다.
6. 배양 접시를 부드럽게 몇 번 휘젓고 배양 배지(현탁 세포)를 15mL 플라스틱 원뿔형 튜브에 넣습니다. 배양 접시에 부착된 세포(대부분 대식세포)를 버립니다.
7. 600 x g에서 상온에서 5분 동안 원심분리기 상층액을 버립니다.
8. 펠릿을 1mL의 RPMI 1640 배지로 재현탁합니다. 혈구계 또는 자동 세포 계수기로 세포 수를 세십시오.
   메모: 분리된 백혈구의 생존력은 일반적으로 트리판 블루 배제에 의해 90% 이상입니다.
9. 단계 1.7에서와 같이 원심분리하고 5 - 10 x 10⁶ cells/mL의 농도로 ~ 200 μL의 차가운 PBS 완충액(0.5% 소 혈청 알부민(BSA) 및 2 mM EDTA)에 세포를 재현탁합니다.
10. 10⁶ 세포당 혈액 세포에 특이적인 5 μL의 비오틴화된 항-인간 Ab 칵테일(B 세포의 음성 선택용)을 추가하고 얼음에서 30분 동안 배양합니다.
    메모: 항인간 Ab 칵테일은 최소한 CD2(또는 CD3), CD14 및 CD16에 특이적인 Abs를 포함해야 합니다.
11. 10배 이상의 멸균 PBS를 세포에 첨가하고 600 x g에서 5분 동안 원심분리한 다음 상층액을 버립니다.
12. 펠릿에 동일한 양의 streptavidin-conjugated microbeads(10⁶개 세포당 5μL)를 추가하고 철저히 혼합합니다.
13. 15mL 플라스틱 원뿔형 튜브에서 얼음 위에서 30분 동안 배양합니다.
14. PBS 완충액 2mL를 튜브에 추가합니다.
15. 튜브를 마그네틱 스탠드에 넣고 RT에서 8분 동안 배양합니다. 갈색 마이크로비즈는 자석 옆의 튜브 벽에 점차적으로 부착됩니다.
16. 튜브를 마그네틱 스탠드에 남겨둔 상태에서 상층액을 새 멸균 15mL 튜브로 조심스럽게 옮깁니다.
17. 1.14-1.16단계를 반복하고 손대지 않은 B 세포를 포함하는 두 개의 상층액을 결합합니다. 마이크로비즈는 폐기합니다.
18. 600 x g에서 상온에서 5분 동안 원심분리기 상층액을 버립니다.
19. 다운스트림 실험을 위해 펠릿을 RPMI 1640 배지에 재현탁합니다.
    메모: 일반적으로 10 mL의 말초 혈액에서 순도가 95% 이상인 1 - 5 x 10⁵ B 세포를 분리할 수 있습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
BD 바쿠테이너 K2E	BD 바이오사이언스	367525	10ml 튜브
Ficoll-Paque 플러스	GE 헬스케어	Tel.: 17-1440-02	내독소 무함유
트리판 블루 0.5% 용액	생물 산업	03-102-1B	염료
IMag Human B 림프구 농축 세트	BD 바이오사이언스	558007	시약
Streptavidin 마그네틱 마이크로비즈	BD 바이오사이언스	9000810	시약
15ml 팔콘 튜브	BD 팔콘	352196	플라스틱 도자기
비오틴화 CD27 mAb	바이오레전드	302804	클론 O323
비오틴화 항인간 CD27	바이오레전드	302804	클론 O323
비오틴화 항인간 CD27	이바이오사이언스	Tel.: 13-0279-80	클론 O323