Method Article

다양한 순환 B 세포 집단에 대한 유세포 분석 기반 세포 분류

July 8th, 2025

In This Article

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

출처: Tzeng, S. J. 혈액에서 인간 항체 분비 B 세포의 분리, 분화 및 정량화: 체액 면역의 기능적 판독으로서의 ELISpot. J. Vis. 특급 (2016).

이 비디오에서는 인간 말초 혈액 B 세포에서 naive B cell, memory B cell 및 plasmablast plasma cell subpopulation의 유세포 분석 기반 분류를 위한 프로토콜에 대해 설명합니다. 서로 다른 B 세포 하위 집단은 B 세포 표면에서 발현된 CD19, CD27 및 CD38 수용체에 대한 형광단 기반 항체 결합에 따라 구별된 후 세포 분류를 기반으로 구별할 수 있습니다.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

인간 참가자와 관련된 모든 절차는 인간 복지를 위한 제도적, 국가적, 국제적 지침에 따라 수행되었으며 지역 기관 검토 위원회의 검토를 거쳤습니다.

1. Naive B 세포, Memory B 세포 및 플라즈마 세포/플라즈마 세포(PB/PC) 수집을 위한 세포 분류

  1. 정제된 인간 말초 혈액 B 세포를 사용하여 혈구계 또는 자동 세포 계수기를 사용하여 세포 수를 측정합니다.
  2. 5mL 폴리스티렌 튜브에서 mL당 107 농도의 차가운 PBS 완충액에 세포를 재현탁합니다.
  3. 106 세포당 1 - 2 μg의 인간 IgG를 추가하고 Fc 블록을 위해 10분 동안 얼음에서 배양합니다.
  4. 106 세포 당 anti-CD19-APC (클론 : HIB19), anti-CD27-eFluor450 (클론 : O323) 및 anti-CD38-PE (클론 : HIT2)를 각각 1 μg씩 첨가합니다. 잘 섞고 얼음에서 30 분 동안 배양합니다.
  5. 1.4 단계의 마지막 5 분 동안 상업용 7-아미노 악티노마이신 D(7-AAD) 5μL를 추가합니다.
  6. PBS 2mL를 튜브, 와류 및 원심분리기에 600 x g으로 5분 동안 추가합니다.
  7. 15-mL 튜브에서 mL당 1 - 5 x 107 세포의 농도로 분류 완충액(2% BSA 및 2mM EDTA가 포함된 멸균 PBS)에 세포를 재현탁합니다.
  8. 나일론 메쉬 셀 스트레이너(40μm 공극 크기)를 통해 세포를 여과하여 세포 덩어리를 제거합니다.
  9. 보라색(405nm), 파란색(488nm), 빨간색(640nm)의 세 가지 레이저가 장착된 유세포 분석 분류기로 세포를 분리합니다.
    참고: 블루 레이저만으로도 3색 유세포 분석에 충분합니다.
  10. naive B 세포(CD19+CD27-), 메모리 B 세포(CD19+CD27+) 및 PB/PC(CD19+CD27+/hiCD38+)를 동시에 수집하기 위해 세포를 3개의 15mL 튜브(RPMI 배지 5mL 포함)로 분류합니다.
    메모: 분류된 naive 및 memory B 세포를 추가로 배양할 수 있습니다.

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
선언된 이해 상충이 없습니다.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
15 mL 팔콘 튜브BD 팔콘352196
블루 나일론 메쉬 셀 스트레이너, 40 μmBD 팔콘352340
안티 휴먼 CD19-APC바이오레전드302212클론 HIB19
안티-휴먼 CD27-eFluor 450이바이오사이언스Tel.: 48-0279-42클론 O323
안티 휴먼 CD38-PE-Cy7바이오레전드303516클론 히트
안티 휴먼 CD38-PE-Cy7BD 바이오사이언스560677클론 히트
안티 휴먼 CD45-FITC바이오레전드304006클론 HI30
안티 휴먼 CD45-FITCBD 바이오사이언스555482클론 HI30
안티 마우스 / 쥐 / 인간 CD27- PerCP Cy5.5바이오레전드124213클론 LG.3A10
안티 휴먼 CD27-PerCP Cy5.5BD 바이오사이언스65429클론 L128
안티 휴먼 CD19-FITC밀테니 바이오텍Tel.: 130-098-064클론 LT19
안티 휴먼 CD19-FITC진텍스GTX75599클론 LT19
안티 휴먼 CD20-FITCBD 바이오사이언스555622클론 2H7
7-아미노악티노마이신 D(7-AAD)BD 바이오사이언스559925
인간 IgG잭슨 이뮤노리서치TEL.009-000-003
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Flow CytometryCell SortingB Cell PopulationsNaive B CellsMemory B CellsPlasmablast Plasma CellsCD19 CD27 CD38Fluorescent AntibodiesDead Cell MarkerFACS Buffer

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