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인간 참가자와 관련된 모든 절차는 인간 복지를 위한 제도적, 국가적, 국제적 지침에 따라 수행되었으며 지역 기관 검토 위원회의 검토를 거쳤습니다.
인간의 말초 혈액은 정보에 입각한 동의하에 건강한 기증자로부터 얻어야 하며, 혈액 샘플의 사용은 검토 위원회가 정한 승인된 지침을 따라야 합니다. 이 연구에서는 유세포 분석(그림 1) 및 ELISpot 분석(그림 2) 결과를 시연하기 위해 인간 혈액을 사용하는 프로토콜입니다.
1. 인간 말초 혈액 B 세포의 분리 및 정제
- 정중 큐비탈 정맥(팔꿈치 앞쪽의 큐비탈 포사)에서 ~ 10mL의 혈액을 K2EDTA(1.5 - 2.0 mg/mL 혈액)가 들어 있는 15mL 튜브에 넣고 즉시 튜브를 여러 번 뒤집어 혈전 형성을 방지합니다.
- 신선한 혈액 샘플(≥ 3:1 vol/vol)이 들어 있는 튜브에 오토클레이브(121°C, 15분) 적혈구(RBC) 용해 완충액(150mM NH4Cl, 10mM KHCO3 및 1mM EDTA, pH 7.4) 35mL를 추가하고 실온(RT)에서 5분 이상 배양하지 않습니다.
메모: 튜브를 통한 광 투과가 나타나면 적혈구 용해가 완료되었음을 나타냅니다.
- 600 x g에서 상온에서 5분 동안 원심분리기 펠릿이 흰색인지 확인합니다.
- 10mL의 오토클레이브 인산염 완충 식염수(PBS, 137mM NaCl, 2.7mM KCl, 4.3mM Na2HPO4 및 1.47mM KH2PO4, pH 7.4)와 1.3단계와 같이 원심분리로 펠릿을 재현
탁합니다.
- 상등액을 버리고 RPMI 1640 배지 10mL(보충제: 10% 태아 송아지 혈청, 100U/mL 페니실린/스트렙토마이신, 0.25μg/mL 암포테리신 B 및 2mM L-글루타민)로 펠릿을 재현탁한 다음 세포를 10cm 배양 접시(접시당 혈액 10mL)에 플레이트합니다. 접시를 37% CO5의 2°C 인큐베이터에 30분 동안 놓습니다.
- 배양 접시를 부드럽게 몇 번 휘젓고 배양 배지(현탁 세포)를 15mL 플라스틱 원뿔형 튜브에 넣습니다. 배양 접시에 부착된 세포(대부분 대식세포)를 버립니다.
- 600 x g에서 상온에서 5분 동안 원심분리기 상층액을 버립니다.
- 펠릿을 1mL의 RPMI 1640 배지로 재현탁합니다. 혈구계 또는 자동 세포 계수기로 세포 수를 계산합니다.
메모: 분리된 백혈구의 생존력은 일반적으로 트리판 블루 배제에 의해 90% 이상입니다.
- 단계 1.7에서와 같이 원심분리하고 5 - 10 x 106 cells/mL의 농도로 ~ 200 μL의 차가운 PBS 완충액(0.5% 소 혈청 알부민(BSA) 및 2 mM EDTA)에 세포를 재현탁합니다.
- 106 세포당 혈액 세포에 특이적인 5 μL의 비오틴화된 항-인간 Ab 칵테일(B 세포의 음성 선택용)을 추가하고 얼음에서 30분 동안 배양합니다.
메모: 항인간 Ab 칵테일은 최소한 CD2(또는 CD3), CD14 및 CD16에 특이적인 Abs를 포함해야 합니다.
- 10배 이상의 멸균 PBS를 세포에 첨가하고 600 x g에서 5분 동안 원심분리한 다음 상층액을 버립니다.
- 펠릿에 동일한 양의 streptavidin-conjugated microbeads(106개 세포당 5μL)를 추가하고 철저히 혼합합니다.
- 15mL 플라스틱 원뿔형 튜브에서 얼음 위에서 30분 동안 배양합니다.
- PBS 완충액 2mL를 튜브에 추가합니다.
- 튜브를 마그네틱 스탠드에 넣고 RT에서 8분 동안 배양합니다. 갈색 마이크로비즈는 자석 옆의 튜브 벽에 점차적으로 부착됩니다.
- 튜브를 마그네틱 스탠드에 남겨둔 상태에서 상층액을 새 멸균 15mL 튜브로 조심스럽게 옮깁니다.
- 1.14-1.16단계를 반복하고 손대지 않은 B 세포를 포함하는 두 개의 상층액을 결합합니다. 마이크로비즈는 폐기합니다.
- 600 x g에서 상온에서 5분 동안 원심분리기 상층액을 버립니다.
- 다운스트림 실험을 위해 펠릿을 RPMI 1640 배지에 재현탁합니다.
메모: 일반적으로 10 mL의 말초 혈액에서 순도가 95% 이상인 1 - 5 x 105 B 세포를 분리할 수 있습니다.
2. 고립된 B 세포에서 기억과 나이브 B 세포의 정제 및 분리
- 1단계에서 정제된 세포를 사용하고 혈구계 또는 자동 세포 계수기를 사용하여 세포 수를 측정합니다.
- 600 x g에서 원심분리 후 100μL의 차가운 PBS 완충액에 세포를 재현탁시키고 5분 동안 실온합니다.
- 106 세포 당 1 - 2 μg의 비오틴화된 CD27 mAb를 첨가하고 얼음에서 30분 동안 배양합니다.
- PBS 완충액 10mL를 튜브에 넣고 600 x g에서 5분 동안 원심분리합니다.
- 상층액을 버리고 50μL의 PBS 완충액에 세포를 재현탁합니다.
- 동일한 양의 streptavidin 마그네틱 마이크로비드(1 - 2 μg/106 cells)를 15mL 플라스틱 원뿔형 튜브의 세포에 추가합니다.
- 부드럽게 잘 섞어 얼음 위에서 30분 동안 배양합니다.
- 튜브에 2 - 3 mL의 PBS 완충액을 추가합니다.
- 튜브를 마그네틱 스탠드에 넣고 RT에서 8분 동안 배양하여 갈색 마이크로비즈가 자석에 가장 가까운 쪽에 부착되도록 합니다.
- 튜브를 마그네틱 스탠드에 넣은 상태에서 상등액 분획을 새 멸균 튜브로 조심스럽게 옮깁니다. 이 분획은 농축된 CD27- 나이브 B 세포를 포함합니다.
- 마이크로비드가 들어 있는 튜브에 5mL를 추가하고 마이크로비드(즉, CD27+ 메모리 B 세포의 농축된 분획)를 부드럽게 재현탁합니다.
- 600 x g에서 상온에서 5분 동안 원심분리기 다운스트림 실험을 위해 RPMI 1640 배지로 펠릿을 재현탁합니다.
메모: 일반적으로 B 세포의 ~ 30 - 60%는 건강한 기증자의 PBMC에서 CD27+ 메모리 세포로 정제될 수 있습니다.
3. Naive B Cells, Memory B Cells 및 PB/PC 수집을 위한 Cell Sorting
- 1단계에서 정제된 세포를 사용하여 혈구계 또는 자동 세포 계수기를 사용하여 세포 수를 측정합니다.
- 5mL 폴리스티렌 튜브에서 mL당 107 농도의 차가운 PBS 완충액에 세포를 재현탁합니다.
- 106 세포당 1 - 2 μg의 인간 IgG를 추가하고 Fc 블록을 위해 10분 동안 얼음에서 배양합니다.
- 106 세포 당 anti-CD19-APC (클론 : HIB19), anti-CD27-eFluor450 (클론 : O323) 및 anti-CD38-PE (클론 : HIT2)를 각각 1 μg씩 첨가합니다. 잘 섞고 얼음에서 30 분 동안 배양합니다.
- 3.4 단계의 마지막 5 분 동안 상업용 7-아미노 악티노마이신 D(7-AAD) 5μL를 추가합니다.
- PBS 2mL를 튜브, 와류 및 원심분리기에 600 x g으로 5분 동안 추가합니다.
- 15-mL 튜브에서 mL당 1 - 5 x 107 세포의 농도로 분류 완충액(2% BSA 및 2mM EDTA가 포함된 멸균 PBS)에 세포를 재현탁합니다.
- 나일론 메쉬 셀 스트레이너(40μm 공극 크기)를 통해 세포를 여과하여 세포 덩어리를 제거합니다.
- 보라색(405nm), 파란색(488nm), 빨간색(640nm)의 세 가지 레이저가 장착된 유세포 분석 분류기로 세포를 분리합니다.
메모: 블루 레이저만으로도 3색 유세포 분석에 충분합니다.
- naive B cell(CD19+CD27-), memory B cell(CD19+CD27+) 및 PB/PC(CD19+CD27+/hiCD38+)를 동시에 수집하기 위해 세포를 3개의 15-mL tube(5mL RPMI 배지 포함)로 분류합니다.
메모: 분류된 naive 및 memory B cell은 4단계에서 설명한 대로 배양할 수 있습니다.
4. 분리된 인간 CD19+ B 세포, CD19+CD27+ 메모리 B 세포 및 CD19+CD27- Naive B 세포의 체외 분화
- 1.19, 2.10, 2.11 및 3.10단계에서 정제된 세포를 사용하여 혈구계 또는 자동 세포 계수기로 세포 수를 측정합니다.
- RPMI 1640 배지를 mL당 1 - 10 x 105의 농도로 세포를 재현탁하고 12웰 플레이트의 웰로 분취합니다.
- 5μg/106셀/mL에서 CpG(ODN 2006)를 추가합니다.
- 37 °C 인큐베이터에서 5 일 동안 5 % CO2로 세포를 배양합니다.
- 각 웰에서 세포를 채취하여 15mL 튜브에 따로 넣고 각 튜브에 PBS 5mL를 추가한 다음 600 x g에서 원심분리하고 5분 동안 실온합니다.
- 혈구계 또는 자동 세포 계수기를 사용하여 세포를 계수합니다. RPMI 1640 배지를 사용하여 mL당 1 - 10 x 105의 농도로 세포를 재현탁합니다.
5. ELISpot 분석
- 증류수에 포함된 35% 에탄올 30μL를 ELISpot 플레이트의 각 웰에 30초 동안 추가합니다.
메모: 피펫팅을 할 때 항상 웰의 멤브레인을 만지지 마십시오.
- ELISpot 플레이트를 뒤집어 에탄올을 제거합니다.
- 150μL의 오토클레이브 ddH2O를 각 웰에 넣고 RT에서 5분 동안 배양하여 잔류 에탄올을 씻어냅니다. 이후 RT에서 3분 동안 멸균 PBS를 세척합니다.
메모: 5.1-5.3단계는 플레이트 제조에 따라 선택 사항일 수 있습니다.
- 50μL의 5μg/mL 다클론 F(ab')2 항인간 Ig(IgG + IgM + IgA)(PBS) 단편을 ELISpot 플레이트의 각 웰에 넣고 4°C에서 하룻밤(선호) 또는 37°C에서 2시간 동안 배양합니다.
메모: 사용할 때까지 파라필름으로 접시 가장자리를 밀봉하십시오.
- 플레이트를 뒤집어 결합되지 않은 Ab를 제거하고, 각 웰에 200μL의 PBS를 첨가하고, 매번 3분 동안 RT에서 두 번 배양합니다.
- 차단을 위해 각 웰에 5% BSA(또는 RPMI 1640 배지)가 포함된 PBS 200μL를 추가하고 RT에서 2시간 동안 배양합니다.
- 플레이트를 뒤집어 차단 버퍼를 제거합니다. 5.5단계와 같이 200μL의 PBS로 각 웰을 두 번 세척합니다.
- 각 웰에 100μL의 RPMI 1640 배지를 추가하고 37°C에서 배양합니다.
- 세포를 시딩할 준비가 되면 플레이트를 뒤집어 RPMI 1640 배지를 제거합니다.
- 100 μL(5 x 104), 50 μL(2.5 x 104) 및 25 μL(1.25 x 104)의 세포(1.19, 2.10, 2.11, 3.10 및 4.6 단계)를 ELISpot 플레이트의 웰에 시딩합니다. RPMI 1640 매체를 사용하여 부피를 150μL/well로 가져옵니다.
메모: 세포 도금을 위해 최소 1개 또는 2개의 2배 연속 희석이 권장됩니다.
- 37 ° C 인큐베이터에서 5 % CO2로 플레이트를 8 - 14 시간 동안 배양합니다.배양 중에는 플레이트를 움직이지 마십시오.
- 플레이트를 뒤집어 셀과 RPMI 1640 배지를 제거합니다.
- 200μL/웰의 PBS-T(0.05% Tween 20이 포함된 PBS)를 추가하고 RT에서 5회, 매번 3분 동안 배양합니다. 플레이트를 뒤집어 5회 세척할 때마다 세척 버퍼를 제거합니다.
- 염소 항-인간 IgG-알칼리 인산가수분해효소(AP), Fcγ-특이적 Abs(IgG 검출, PBS-T에서 1:5,000) 또는 염소 항-인간 IgM-AP, Fcμ 단편 특이적 Abs(IgM 검출, PBS-T에서 1:5,000)를 지정된 웰에 추가하고 어둠 속에서 2시간 동안 RT에서 배양합니다.
- 5.5단계와 같이 200μL의 PBS로 각 웰을 두 번 세척합니다.
- 50μL/웰의 브로모클로로인돌릴 포스페이트-니트로 블루 테트라졸륨(BCIP/NBT) 기질 용액을 추가합니다. 보라색 반점은 일반적으로 5-15분 후에 나타납니다.
- 스폿의 과도한 발달을 방지하기 위해 100μL/well의 ddH2O를 추가합니다.
- 모든 반점이 완전히 발달한 후 흐르는 수돗물로 플레이트를 헹굽니다.
- 플레이트의 언더드레인을 제거하고 어둠 속에서 자연 건조시키십시오.
- 이미지 획득/분석 장치가 있는 자동 플레이트 리더(예: 자동 스캐너 또는 해부 현미경을 통한 수동)를 사용하여 스폿을 계산합니다.
메모: 플레이트는 어둠 속에서 RT에 보관하고 나중에 분석할 수 있습니다.
