동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.
1. 생쥐의 뼈 수확
- CO2 후 자궁 경부 탈구를 사용하여 동물을 안락사시키고 70% 에탄올을 살포합니다.
메모: 같은 성별, 가급적이면 같은 나이의 동물을 사용하도록 하십시오. 우리는 일상적으로 7주에서 8주 사이의 동물을 사용합니다. 더 나은 대표성과 재현 가능한 세포 집단을 얻기 위해 실험 그룹당 최소 3마리의 동물에서 세포를 풀링하는 것이 좋습니다.
- 안락사된 쥐를 등을 대고 해부판에 올려놓습니다. 집게를 사용하여 복부에 피부 텐트를 만듭니다. 멸균 해부 가위를 사용하여 작은 절개 (약 1cm)를 만듭니다. 하복부와 다리가 보이도록 절단된 부위에서 팔다리와 발 쪽으로 피부를 벗겨냅니다.
- 발목 관절 아래를 잘라 발을 제거합니다. 엉덩이의 장골능을 따라 잘라 대퇴골두와 엉덩이뼈를 분리합니다. 마우스가 등을 대고 있는 동안 엉덩이뼈 중앙을 절개하여 두 개의 장골골을 분리합니다.
- 보푸라기가 없는 물티슈를 사용하여 대퇴골, 경골 및 장골뼈에서 근육을 조심스럽게 제거합니다.
메모: 뼈에서 힘줄과 근육을 가능한 한 많이 자르면 보푸라기가 없는 물티슈(예: Kim 물티슈)로 더 빠르고 쉽게 청소할 수 있습니다. 뼈는 쉽게 부러지는 경향이 있고 특정 유전자형에 따라 뼈의 취약성이 증가할 수 있으므로 뼈를 조작할 때 주의하십시오.
- 모든 샘플을 해부한 후 얼음 위의 PBS에 넣고 나머지 격리 단계를 위해 멸균 배양 후드로 이동합니다.
메모: 가능한 한 많이 무균 작업으로 배양물의 오염 가능성을 줄일 수 있습니다.
- 원심분리기 튜브 내의 절편된 팁에 뼈를 놓기 전에 뼈의 근위부와 원위부 양쪽 끝에서 작은 절개(약 1-2mm)를 만듭니다.
메모: 골수를 원심분리할 수 있도록 충분한 양을 잘라내십시오. 그러나 세포 개체군은 골수 공간 내의 근접성에 따라 달라지는 경향이 있으므로 너무 많이 절단하지 않도록 주의해야 합니다.
- 실온에서 15초 동안 10,000 x g의 원심분리기. 뼈가 삽입물(200μL 피펫 팁 또는 0.75mL 마이크로 원심분리 튜브) 내부에 있는 동안 1.5mL 튜브 바닥에서 모든 골수가 세척되고 펠릿화되었는지 확인합니다. 모든 골수가 채취되면 채취 튜브에서 뼈와 함께 삽입물을 제거합니다.
메모: 모든 골수가 씻겨 나오면 뼈가 하얗게 나타납니다. 그러나 특정 뼈에 골수가 남아 있으면 끝을 다시 자르고 원심분리를 시도하십시오.
2. 세포 현탁액
- 25G 바늘을 사용하여 세포 펠릿을 천천히 위아래로 당겨 덩어리를 분해하고 모든 샘플을 단일 15mL 원뿔형 튜브로 결합합니다. 500μL 샘플당 10mL의 BMSC 배양 배지를 추가합니다.
- 50mL 원뿔형 튜브 위에 70μm 필터를 놓고 이 필터를 통해 세포 현탁액을 통과시켜 가능한 뼈 조각을 제거합니다.
3. 골수 세포의 혼합 집단의 도금 및 배양 (총 BMC)
참고: 세포는 5% CO2가 포함된 인큐베이터에서 37°C에서 배양됩니다.
- 세포 수를 계산하고 배양 배지에서 1.0 x 106 cells/cm2로 플레이트링합니다. 세포가 부착될 때까지 72시간의 혼합 배양을 허용합니다.
메모: 배양 배지에서 세포 현탁액을 20배 희석하고 혈구계를 사용하여 세포를 계수하기 전에 트리판 블루로 다시 희석하는 것이 좋습니다. 생후 7주 된 수컷 C57Bl6/J 마우스의 경우 일상적으로 약 50 x 106 세포의 세포 수를 생성하지만 나이, 성별 및 균주가 세포 수에 큰 영향을 미칠 수 있습니다.
메모: 혼합된 세포 집단은 배양물 웰의 바닥에 부착되어야 합니다.
- 72시간이 지난 후 미디어를 제거하고 새 미디어로 교체합니다. 격일로 미디어를 계속 변경하고 포화도를 확인합니다. 세포가 80-100% 포화도에 도달하면 분화 준비가 된 것입니다.
메모: 이 배양은 BMSC와 HSC와 혼합되어 있기 때문에 골모세포형성, 지방형성 및 골형성에 직접 사용할 수 있습니다.
4. BMSC(Adherent BMSC)의 분할 모집단의 도금 및 배양
참고: 세포는 5% CO2가 포함된 인큐베이터에서 37°C에서 배양됩니다.
- 한 마우스의 대퇴골, 경골 및 장골 뼈에서 수집한 모든 세포를 10cm 배양 접시(배양 면적의 55cm2)에 플레이트합니다.
메모: 2-3 C57BL/6J 마우스를 풀링할 때 일반적으로 이 '총' 골수 집단을 150cm2 플라스크에 플레이트화합니다.
- 혼합 배양 48시간 후 배양 배지(비부착성 HSC 포함)를 제거합니다. 파골세포형성 실험을 수행해야 하는 경우, 이 비부착성 세포 집단을 따로 설정하고(섹션 7 참조), 그렇지 않은 경우 이 세포를 흡인하고 폐기합니다.
- 부착된 세포를 방해하지 않도록 PBS로 플레이트/플라스크를 조심스럽게 세척하십시오.
- PBS를 제거하고 0.25% 트립신을 첨가하여 세포를 들어 올리고 37°C에서 1-3분 동안 배양합니다. 세포 현탁액에 세포 배지를 추가하여 트립신을 담금질합니다. 이 시점에서 현재 해제된 BMSC를 계수하고(이전에 4.1단계에서 수행한 것처럼) 향후 실험을 위해 도금할 수 있습니다.
- 도금에 필요한 셀 수를 계산합니다. 실온에서 5분 동안 1,000 x g에서 필요한 부피의 세포 현탁액을 원심분리합니다.
메모: 세포는 일반적으로 종말점 실험을 기반으로 도금됩니다. 예를 들어, 단백질/RNA를 분리해야 하는 경우 일반적으로 더 높은 밀도(6웰 플레이트에서 ~1.0-2.0 x 106 세포/웰)로 플레이트를 만듭니다.
- 배지를 제거하고 세포 펠렛을 도금에 필요한 배양 배지의 부피로 재현탁시킵니다. 실험에 따라 배양 배지에 세포를 플레이트하고 며칠 동안 부착하도록 합니다. BMSC가 합류점에 도달하면 차별화를 진행합니다.
