인간 말초 혈액 단핵 세포에서 활성화된 T 세포의 배양

초록

출처: Mølgaard, K., et al. 사이토카인 분화된 인간 일차 T 세포에서 미토콘드리아 호흡의 실시간 모니터링. J. Vis. 특급 (2021).

이 비디오에서는 인간 1차 T 세포 활성화를 위한 프로토콜에 대해 설명합니다. 항-CD3 및 항-CD28 항체로 코팅된 마그네틱 비드로 미접촉 T 세포를 배양한 후 인터루킨-2 또는 인터루킨-15 처리를 진행하면 미접촉 T 세포가 활성화되고 분화 및 이펙터 또는 기억 T 세포로 증식합니다.

프로토콜

인간 참가자와 관련된 모든 절차는 인간 복지를 위한 제도적, 국가적, 국제적 지침에 따라 수행되었으며 지역 기관 검토 위원회의 검토를 거쳤습니다.

1. 활성화된 인간 1차 T 림프구 배양

1. 세포 해동(1일차)
   1. 샘플당 RPMI 1640 10mL를 약 37°C로 예열합니다.
   2. 원하는 수의 말초 혈액 단핵 세포 앰플을 가져 와서 드라이 아이스에 임시로 보관하십시오.
   3. 예열된 RPMI 1640 10mL에 동결된 세포를 재현탁합니다.
   4. RT에서 500 x g에서 5분 동안 세포를 원심분리합니다.
   5. 상층액을 버리고 1.1.4에 설명된 대로 10mL의 RPMI 1640 및 원심분리기에 재현탁하여 세포를 다시 세척합니다.
   6. 상층액을 버리고 X-VIVO 15 배지 + 5% 인간 혈청(이하: T 세포 배지) mL당 2 x 10⁶ 세포로 세포를 재현탁합니다.
   7. 24웰 세포 배양 플레이트에 웰당 세포 2mL를 플레이트화하고 37°C 및 5% CO₂에서 하룻밤 동안 배양합니다.
2. 세포 활성화(Day 0)
   1. 세포 100만 개당 12.5μL의 비드를 마이크로 원심분리기 튜브로 옮겨 CD3/CD28 비드를 세척합니다. 비드 12.5μL당 PBS 12.5μL를 추가합니다
      메모: 사용하기 전에 구슬 바이알을 소용돌이치는 것이 중요합니다.
   2. 미세 원심분리기 튜브를 적절한 자석에 1분 동안 놓습니다.
   3. 완충액을 버리고 T 세포 배지의 원래 부피(비드의 원래 부피 12.5μL당 12.5μL의 T 세포 배지)로 비드를 재현탁합니다.
   4. 1:2의 비율에 해당하는 세포 100만 개당 12.5μL의 비드를 추가합니다(비드: 세포).
   5. 세포를 각각 약 500만 개의 세포가 있는 두 가지 조건으로 나눕니다.
   6. 표 1에 언급된 대로 조건에 올바른 부피의 사이토카인을 추가합니다.
   7. 세포를 37 °C 및 5 % CO₂에서 3 일 동안 배양합니다.
3. 세포 배양(3일차 및 5일차)
   1. 세포를 다시 현탁시키고 각 웰에서 부피의 절반을 새 웰로 옮겨 세포를 분리합니다. 각 웰에 동일한 부피의 신선한 T 세포 배지를 추가합니다.
   2. 표 1에 언급된 대로 각 조건에 새로운 사이토카인을 추가합니다.

명 명

	사이토카인	주식	희석 계수	결승전
조건 1	일리노이 -2	3 x 106 U/mL	30,000	100 U/mL
조건 2	일리노이 - 15	2 x 105U/mL	2,000	100 U/mL

표 1: T 세포의 대사 변화를 유도하는 데 사용되는 사이토카인 배양의 준비.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
24웰 조직 배양 플레이트	눕크	142485
안티-CD3xCD28 비드	지브코	11161디
X-비보 15	론자	BE02-060F
휴먼 세럼	시그마 알드리치	H4522	56°C에서 30분 동안 불활성화
일리노이 - 15	페프로텍	200-02
일리노이 -2	페프로텍	200-15
림프렙	스템셀 기술	7801
PBS (PBS)	써모 피셔	10010023
RPMI 1640	Gibco-Thermo Fisher	61870036
T 셀 비즈 자석 DynaMag-2 자석	써모 피셔	12321디

년 년 년