Murine Pancreatic Draining Lymph Nodes에서 조절 T 세포 subsets 확인

초록

출처: Luo, Z., et al. 유세포 분석을 사용하여 쥐 흉선, 췌장 배출 림프절 및 비장의 조절 T 세포 부분 집합 결정. J. Vis. 특급(2019년)

이 비디오에서는 쥐 췌장 배출 림프절(PDLN)에서 단일 세포를 분리하는 프로토콜과 유세포 분석을 사용하여 단일 세포 집단에서 조절 T 세포(Tregs)를 특성화하는 방법에 대해 설명합니다. Tregs는 핵 전사 인자 Foxp3 및 Helios와 함께 세포 표면 마커 CD4, CD25 및 Nrp1의 양성 발현을 기반으로 식별됩니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. PDLN에서 단일 셀 절연

1. 랙의 15mL 원뿔형 튜브 위에 멸균 250μm 금속 메쉬를 놓습니다. RPMI 1mL로 메쉬를 헹굽니다.
2. 림프절을 금속 메쉬로 옮기고 핀셋을 사용하여 메쉬를 통해 갈아냅니다. 금속 메쉬에 RPMI 1mL를 바르고 세포를 튜브로 플러시합니다. 3회 더 반복하고 메쉬를 제거합니다.
3. 433 x g에서 4°C에서 5분 동안 튜브를 원심분리하고 상층액을 버립니다.
4. 세포 펠릿을 약 5mL의 RPMI에 재현탁합니다. 튜브에 RPMI를 채웁니다.
5. 433 x g에서 4°C에서 5분 동안 튜브를 원심분리하고 상층액을 버립니다.
6. 세포 펠릿을 약 5mL의 RPMI에 재현탁합니다. 튜브에 RPMI를 채웁니다.
7. 433 x g에서 4°C에서 5분 동안 튜브를 원심분리하고 상층액을 버립니다.
8. 세포 펠릿을 2mL의 RPMI에 재현탁합니다. 세포 현탁액 2mL를 세포 스트레이너 캡이 있는 5mL 원형 바닥 튜브로 옮깁니다. 세포 현탁액을 세포 스트레이너 캡에 적용합니다.

2. 유세포 분석

1. PDLN의 세포 현탁액을 433 x g에서 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 폐기합니다.
2. 100 μL의 유세포 분석 염색 완충액(FACS 완충액)에서 다음 표면 항체로 세포를 염색합니다: 0.75 μg/100 μL FITC-conjugated CD4 항체, 0.60 μg/100 μL APC-H7-conjugated CD8 항체, 0.30 μg/100 μL PE-conjugated CD25 항체, 5 μL (1:20) APC-conjugated Nrp1 항체. 얼음 위에서 튜브를 40분 동안 배양합니다.
3. 각 튜브에 200μL의 FACS 완충액을 추가합니다. 433 x g에서 4°C에서 5분 동안 튜브를 원심분리하고 상층액을 버립니다. 한 번 더 반복합니다.
4. 세포 펠릿을 500μL의 PFB(Permeabilization Fixation Buffer)에 재현탁하여 세포를 고정하고 투과화합니다.
   메모: PFB는 Fixation/Permeabilization Concentrate 1부와 Fixation/Permeabilization Diluent 3부를 혼합하여 제조됩니다.
5. 튜브를 냉장고에 넣고 4°C에서 하룻밤 동안 보관합니다.
   메모: 1 시간 배양도 작동합니다.
6. 433 x g에서 4°C에서 5분 동안 튜브를 원심분리하고 상층액을 버립니다.
7. 세포 펠릿을 500μL의 PWB(Permeabilization Washing Buffer)에 재현탁합니다. 433 x g에서 4°C에서 5분 동안 튜브를 원심분리하고 상층액을 폐기합니다.
   메모: PWB는 증류수에서 Permeabilization Buffer (10x)를 1:10으로 희석하여 제조됩니다.
8. 100 μL의 PWB에서 0.30 μg/100 μL PE-Cy7-conjugated Foxp3 항체, 4 μL (1:25) PacificBlue-conjugated Helios 항체로 세포를 염색합니다. 얼음 위에서 튜브를 1시간 동안 배양합니다.
9. 각 튜브에 500μL의 PWB를 추가합니다. 433 x g에서 4°C에서 5분 동안 튜브를 원심분리하고 상층액을 버립니다.
10. 세포 펠릿을 500μL의 PWB에 재현탁합니다. 433 x g에서 4°C에서 5분 동안 튜브를 원심분리하고 상층액을 버립니다.
11. 세포 펠릿을 300μL의 FACS 완충액에 재현탁합니다.
12. 유세포 분석기에서 세포를 분석합니다.
13. Side Scatter-Area, Height 및 Width 및 Forward Scatter-Area, Height 및 Width를 기준으로 단일 셀에 게이트를 지정합니다. 분석을 위해 100만 개의 이벤트를 실행합니다.
14. 실험의 FCS 파일을 내보내고 유세포 분석 분석기 소프트웨어를 사용하여 분석합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
RPMI-1640	시그마-알드리치	R0883-500ML
eBioscience Foxp3 / 전사 인자 염색 완충액 세트	써모피셔	전화: 00-5523-00	Fixation/Permeabilization Concentrate, Fixation/Permeabilization Diluent 및 Permeabilization Buffer (10x) 함유
eBioscience 유세포 분석 염색 완충액	써모피셔	전화: 00-4222-26
CD4 단클론 항체 (RM4-5), FITC, eBioscience	써모피셔	제11-0042-85
CD25 단클론항체 (PC61.5), PE, eBioscience	써모피셔	Tel.: 12-0251-83
BD Pharmingen APC-H7 쥐 안티마우스 CD8a	BD 바이오사이언스	560182
Mouse Neuropilin-1 APC-conjugated 항체	R&D 시스템	FAB5994A
FOXP3 단클론항체 (FJK-16s), PE-Cyanine7, eBioscience	써모피셔	Tel.: 25-5773-82
Pacific Blue anti-mouse/human Helios 항체	바이오레전드	137220
Falcon 5 mL 둥근 바닥 폴리스티렌 시험관, 셀 스트레이너 스냅 캡 포함	코 닝	352235	35μm 나일론 메쉬가 이중 위치 스냅 캡에 통합되어 있습니다.
튜브 15 mL, 120 mm x17 mm, PP	사르슈테트	62.554.002
유세포 분석	BD (영어)
유세포 분석 소프트웨어	이니바이 테크놀로지스	플로우로직

호