거핵세포와 혈소판 형성의 분화를 위한 체외(In vitro) 방법

초록

출처: Perdomo, J., et al. 인간 제대혈 유래 CD34+ 세포의 거핵세포 분화 및 혈소판 형성. J. Vis. 특급 (2017년)

이 비디오는 거핵세포의 분화와 혈소판 형성을 위한 기술을 보여줍니다. 인간 탯줄 혈액에서 분리된 조혈 줄기 전구 세포는 트롬보포이에틴이 존재하는 상태에서 성숙한 거핵세포로 분화합니다. 성숙한 거핵세포는 프로혈소판(proplatelet)이라고 하는 세포질 확장을 생성하며, 이는 개별 혈소판을 생성합니다.

프로토콜

인간 참가자와 관련된 모든 절차는 인간 복지를 위한 제도적, 국가적, 국제적 지침에 따라 수행되었으며 지역 기관 검토 위원회의 검토를 거쳤습니다.

1. 거핵세포 분화

1. 12웰 플레이트의 웰당 50ng/mL 재조합 인간 트롬보포이에틴(rhTPO)이 보충된 2mL의 SFM에 5 × 10개의 5 cells/mL CD34⁺ 세포를 시드합니다. 가습 분위기에서 37 ° C, 5 % CO₂에서 세포를 배양합니다. 분석에 필요하기 전에 세포가 합류하는 경우, 세포를 수확하고 새로운 배지와 rhTPO.
   를 사용하여 여러 웰로 분할합니다. 메모: 서로 다른 시점(예: 7일, 9일, 10일)에서 분화를 모니터링하기 위해 2개 또는 3개의 웰을 특별히 준비해야 합니다.
2. 다른 웰의 세포를 방해하지 않고 분화를 모니터링하기 위해 따로 보관된 웰에서 세포를 수확합니다.
3. 100 μL의 최종 부피에서 20 μL anti-GPIIb/CD41-FITC 항체 및 10 μL anti-GPIX/CD42a-Alexa Fluor 647 항체로 세포를 염색합니다. 각각의 isotype control 항체를 사용하여 control tube를 설정합니다. 4 °C에서 15 - 30 분 동안 배양합니다.
4. SB 1mL를 넣어 세척합니다. 400 × g에서 10분 동안 원심분리기. 상층액을 버리고 펠릿을 200 - 300 μL의 SB에 재현탁시킵니다.유세포 분석으로 분석합니다.
5. 각 형광단에 대해 isotype control을 분석하여 FITC 및 Alexa Flour 647 양성 모집단에 대한 게이팅을 설정합니다. 염색된 세포 샘플을 분석하여 성숙한 MK를 나타내는 CD41⁺/CD42a⁺ 이중 양성 세포의 비율을 측정합니다(그림 1C).
6. 세포 표면 마커의 현미경 시각화를 위해 1.3에 설명된 대로 세포를 염색합니다.
   1. SB 1mL를 넣어 세척합니다. 400 × g에서 10분 동안 원심분리기. 펠릿을 100μL의 SB에 재현탁시키고 1,000 x g의 유리 슬라이드에서 5분 동안 회전합니다. 슬라이드에 세포를 메탄올에 30초 동안 담궈 세포를 고정합니다. 자연 건조하고, DAPI가 포함된 장착 매체 20μL를 추가하고(재료 표 참조), 커버슬립으로 덮고, 형광 현미경을 사용하여 시각화합니다(그림 2A).
7. 세포 내 항원의 시각화를 위해 PBS에서 세포를 재현탁하고 실온에서 15분 동안 파라포름알데히드(1% 최종 농도)로 고정합니다. 세포를 투과화하기 위해 트리톤-X 100(0.1%)을 첨가하고 15분 동안 배양합니다. 2mL PBS/0.1% triton-X 100으로 셀을 세척합니다. 100μL의 PBS/0.1% triton-X 100에 재현탁하고 anti-vWf 및 anti-CD62p 항체(1:200 희석)를 추가한 다음 실온에서 30분 동안 배양합니다.
   1. 2mL PBS/0.1% triton-X 100으로 세척하고 400 × g에서 10분 동안 원심분리한 후 동일한 완충액 100μL에 재현탁하고 anti-mouse IgG-Alexa 594 및 anti-rabbit IgG-Alexa 488을 추가합니다(1:100). 실온에서 30분 동안 배양하고, 2mL PBS/0.1% triton-X 100으로 세척하고, 동일한 완충액 100μL에 재현탁하고, 20μL의 anti-CD42b-APC를 첨가합니다. 그런 다음 1.6.1단계에 설명된 대로 세포를 유리 슬라이드에 회전시키고 1.6.1단계에 설명된 대로 현미경 시각화를 위한 샘플을 준비합니다.
8. ploidy 측정을 위해 분화 12일 또는 13일에 세포를 수확합니다. SB 1mL를 넣어 세척합니다. 400 × g에서 10분 동안 원심분리기를 하고 100 μL의 최종 부피에서 20 μL 항-GPIIb/CD41-FITC 항체로 염색합니다. 4 °C에서 30분 동안 배양합니다.
   1. SB 1mL로 한 번 세척하고 20μg/ml 프로피듐 요오드화물과 0.05% 트리톤-X 100을 함유한 300μL의 저장성 시트레이트 완충액(1.25mM 시트르산나트륨, 2.5mM 염화나트륨, 3.5mM 포도당)에 펠릿을 재현탁합니다. 빛으로부터 보호된 4 °C에서 15분 동안 배양합니다.
   2. RNase를 최종 농도 20 μg/mL에 추가하고 빛으로부터 보호된 4 °C에서 30분 동안 배양합니다. CD41-FITC⁺ 집단의 30,000 - 50,000 이벤트를 수집하여 유세포 분석을 통해 프로피듐 요오드화물의 강도를 측정합니다(그림 2C).

2. 프로혈소판 계수, 혈소판 계수 및 혈소판 활성화

1. 분화 8일 또는 9일에 세포를 수확하고, 50ng/mL rhTPO가 보충된 200μL의 신선한 SFM에서 48웰 플레이트에서 1 × 10개의 4개 세포/웰에서 파종합니다. 37 °C, 5 % CO₂.
   에서 5 일 동안 배양 메모: 정량 분석을 위해 웰을 세 번 시드합니다. 이 낮은 밀도는 프로혈소판 함유 MK의 시각화 및 계수에 필요합니다. 프로혈소판은 일반적으로 배양 2일 후에 나타나기 시작합니다. 절정은 4일에서 5일 사이입니다.
2. 10X 또는 20X 대물렌즈를 사용하여 도립광 현미경에서 전체 웰의 proplatelet-bearing MK 수를 계산합니다.
   메모: 가열된(37°C) 현미경 스테이지는 세포를 장기간 실온에 유지하면 프로혈소판 확장이 수축되기 때문에 바람직합니다. 프로혈소판은 MK체에서 긴 확장으로 관찰됩니다. 각 MK에는 여러 개의 전혈소판 돌출부가 있을 수 있습니다. 프로혈소판이 발달함에 따라 MK의 몸체는 크기가 줄어듭니다.
3. 세포를 수확하고 실온에서 10분 동안 400 x g에서 원심분리합니다. 1.3단계 및 1.4단계에 설명된 바와 같이 20μL 항인간 CD41-FITC 항체가 있는 염색 세포. 프로혈소판 함유 MK(pbMK)의 백분율 계산:
   pbMK (%) = [(프로혈소판 함유 MK/ 웰) / (총 CD41+ 세포/ 웰)] x 100
4. 배양 배지로 방출된 혈소판을 계수하려면 세포를 파스퇴르 피펫으로 부드럽게 혼합하고 배양 14일 또는 15일에 100μL를 수집합니다.
   1. 4 °C에서 20 - 30분 동안 20 μL 항-인간 CD41-FITC 항체로 염색합니다.각 isotype control antibody를 사용하여 control tube를 설정합니다.
   2. 150 μL의 SB와 50 μL의 카운팅 비드를 추가합니다.
   3. 유세포 분석의 경우 FSC 및 SSC를 로그 스케일로 설정합니다. 섹션 2.4.1에 설명된 대로 CD41-FITC로 염색된 혈소판이 풍부한 혈장에서 추출한 일반 인간 혈소판을 사용하여 혈소판에 대한 게이팅을 설정합니다(그림 3A).
   4. 유세포 분석법으로 beads를 계수하여 염색된 혈소판을 분석합니다. FSC 대 SSC 산점도를 사용하여 카운팅 비드 이벤트 1,000개를 수집합니다(그림 3A). 다음 공식을 사용하여 CD41-FITC 양성 이벤트(그림 3B)를 기반으로 혈소판 수를 계산합니다
      μL당 혈소판=[(CD41-FITC 양성 반응 수)/1,000 비드)] x [(50 μL의 비드 수)/시료 부피)]
5. 혈소판 활성화를 분석하기 위해 세포를 파스퇴르 피펫으로 부드럽게 혼합하고 배양 14일 또는 15일째에 100μL를 수집합니다. Tyrode의 완충액 1mL(137mM NaCl, 2.7mM KCl, 1mM MgCl₂, 1.8mM CaCl₂, 0.2mM Na₂HPO₄, 12mM NaHCO₃, 5.5mM D-glucose, pH 6.5)를 추가하고 200 x g에서 5분 동안 펠릿 세포에 원심분리를 합니다.
   1. 상층액과 원심분리기를 800 x g에서 10분 동안 수집하여 혈소판 크기의 입자를 펠릿화합니다.
   2. 상등액을 버리고 Tyrode 완충액 100μL에 재현탁합니다. 20μL의 PAC1-FITC 항체와 아데노신 이인산(ADP)을 최종 농도 20μM에 추가합니다.실온에서 20분 동안 배양합니다. 유세포 분석으로 분석하여 FITC 양성 이벤트의 백분율을 확인합니다. 양성 대조군과 동일한 방식으로 처리된 신선한 인간 혈소판을 사용합니다(그림 3C).

결과

그림 1: 배양에서 CD34+ 세포 분리 및 MK 분화에 대한 유세포 분석 플롯. (A) 인간 제대혈에서 정제된 단핵 세포(왼쪽 패널과 같이 게이트)를 항-CD34-PE 항체로 염색하여 샘플에서 CD34⁺ 세포의 비율을 측정했습니다(1.3%, 오른쪽 패널). (B) 분리 후, 양성 분획을 anti-CD34-PE 및 anti-CD45 PerCP 항체로 염색 하였다. 농축된 CD34⁺ 모집단이 그림에 표시되어 있습니다(98.1%, 오른쪽 패널, 오른쪽 상단 사분면). (C) 7일 또는 11일 동안 CD34+ 세포와 시험관내에서 분화된 MK의 표현형 분석을 항-CD41 및 항-CD...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
세포 배양 시약
재조합 인간 TPO	밀테니 바이오텍	Tel.: 130-094-013
스템스팬 SFEM II	줄기세포 기술	9605	CD34+ 세포를 위한 무혈청 배지
유세포 분석 및 세포 염색 시약
PE 마우스 안티 휴먼 CD34	BD 바이오사이언스	340669	8G12를 복제합니다. 이는 CD34 순도 검사에 사용할 수 있습니다. 최종 항체 농도 1:10 희석.
PerCP 마우스 안티 휴먼 CD45	BD 바이오사이언스	347464	1:10 희석
PerCP isotype 제어	BD 바이오사이언스	349044	1:10 희석
FITC 마우스 안티 휴먼 CD41a	BD 바이오사이언스	340929	최종 항체 농도 1:5 희석.
APC 마우스 안티 휴먼 CD42b	BD 바이오사이언스	551061	이 항체는 또한 성숙한 MK(일반적으로 항 CD42a보다 낮은 양성 세포의 비율)를 검출하는 데 사용할 수 있습니다. 최종 항체 농도 1:10 희석.
Alexa Fluor 647 마우스 안티 휴먼 CD42a	AbD 세로텍	MCA1227A647T	현재 Bio-Rad에서 배포하고 있습니다. 최종 항체 농도 1:10 희석.
Alexa Fluor 647 마우스 네거티브 컨트롤	AbD 세로텍	MCA928A647	현재 Bio-Rad에서 배포하고 있습니다. 동형(Isotype) 대조군 항체
안티 폰 빌레브란트 인자 토끼 다클론성	아브캠	AB6994	1:200 희석
V450 마우스 안티 험나 CD41a	BD 바이오사이언스	58425	1:20 희석
V450 아이소타입 컨트롤	BD 바이오사이언스	580373	1:20 희석
PAC1-FITC 항체	BD 바이오사이언스	340507	1:10 희석
안티 CD62p 마우스 단클론	아브캠	AB6632	1:200 희석
Alexa Fluor 488 염소 안티 토끼 IgG	인비트로젠	A11008	1:100 희석
Alexa Fluor 594 염소 안티 마우스 IgG	인비트로젠	A11020	1:100 희석
IG 아이소타입 컨트롤 칵테일-C	BD 바이오사이언스	558659	동형(Isotype) 대조군 항체
프로피듐 요오드화물	시그마 알드리치	P4864
CountBright 앱솔루트 카운팅 비드	분자 프로브, Invitrogen	C36950	구슬 계산
자료
Falcon 5mL 둥근 바닥 폴리프로필렌 FACS 튜브, 스냅 캡 포함, 멸균	In Vitro 기술	352063
유리 슬라이드	멘젤-글레이저	J3800AMNZ
DAPI를 사용하여 미디어 마운트	벡터 연구소	H-1200	DAPI를 사용한 페이드 방지 장착 매체
설비
도립 현미경	라이카	DMIRB 도립 현미경
형광 현미경	자이스	정점 A1
세포 분석기	BD 바이오사이언스	FACS 칸토 II
사이토스핀 원심분리기	써모사이언티픽	사이토스핀 4
소프트웨어
세포 분석기 소프트웨어	BD 바이오사이언스	FACS 디바 소프트웨어
단일 세포 분석 소프트웨어	트리 스타	플로우조
형광 현미경 소프트웨어	자이스	젠 2 블루 에디션