방법 논문

iPSC 유래 흉선 이민자를 생성하기 위한 3차원 흉선 배양 시스템

2025년 7월 8일

이 논문에서

초록

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출처: Vizcardo, R., et al. 쥐 유도 만능 줄기 세포 유래 종양 항원 특이적 흉선 이민자를 생성하기 위한 3차원 흉선 배양 시스템. J. Vis. 특급 (2019).

이 동영상은 3차원 흉선 배양 시스템을 사용하여 iPSC 유래 미성숙 T 세포에서 기능적 항원 특이적 T 세포를 생성하는 프로토콜을 보여줍니다. iPSC 유래 미성숙 T 세포를 내인성 림프구가 고갈된 마우스 태아 흉선엽과 함께 배양한 결과, T 세포가 성공적으로 성숙하여 CD8αβ+ MHC 클래스 I+ iPSC 유래 흉선 이민자(iTE)를 형성했습니다.

프로토콜

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동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 3D iTE를 생성하기 위한 흉선 장기 배양

  1. 마우스 태아 흉선을 채취하고 데옥시구아노신(dGUO) 처리를 통해 내인성 림프구를 배치합니다.
  2. dGUO 치료 7일차에 10cm 크기의 새 접시 4개를 가져다가 각각 20mL의 완전한 배지(Roswell Park Memorial Institute Media 1640 [RPMI 1640] + 10% FBS + 1x L-알라닐-L-글루타민 + 1x 피루브산 나트륨 + 비필수 아미노산(MEM-NEAA) + 1x 페니실린-스트렙토마이신 1개 + [1:1000] 2-메르캅토 에탄올)을 채웁니다.
  3. 흉선엽이 있는 모든 니트로셀룰로오스 멤브레인을 10cm 접시 하나로 옮깁니다. 겸자로 막에서 개별 엽을 분리하여 매체에 잠길 수 있도록 합니다. 멤브레인을 버리십시오. RT에서 1시간 동안 배양합니다.
  4. 흉선엽을 완전한 배지가 있는 새 10cm 접시로 옮기고 RT에서 1시간 동안 배양합니다. 이 단계를 2회 더 반복합니다.
  5. 겸자를 사용하여 흉선엽을 접시에 고정하고(한 번에 하나씩) 다른 손으로 중앙을 100-200μm 깊이로 절개하고 엽 지름의 절반을 확장하여 T 세포 전구 세포가 엽으로 쉽게 이동할 수 있도록 합니다.
  6. 흉선엽을 완전한 분화 배지(완전한 배지 + 5ng/mL 마우스 인터루킨-7(IL-7) + 5ng/mL 마우스 Flt3 리간드(FLT3L) + 5ng/mL 줄기세포 인자(SCF))로 채워진 새로운 10cm 접시로 옮깁니다.
  7. 선택적으로, 하부 및 상부 그리드가 있는 3D 배양 플레이트를 사용하는 경우, 매달린 방울의 증발 및 건조를 방지하기 위해 두 그리드를 모두 멸균 PBS로 채웁니다.
  8. 1.6단계에서 dGuo 처리된 흉선 엽 1개를 포함하는 30μL의 전체 배지를 3D 배양 플레이트의 각 웰로 옮깁니다.
  9. OP9/DLL1 공동 배양(16-21일)에서 비부착 T 계통 세포(iPSC 유래 미성숙 T 세포)를 수집하고 20μL 배지당 2–5 x 103 T 계통 세포에서 재현탁합니다.
  10. 20μL의 T 계통 세포 현탁액을 3D 배양 플레이트의 각 흉선엽에 추가합니다. 37 ° C에서 5 % CO2로 밤새 배양하십시오.
  11. P200 피펫을 30μL로 설정하고 각 웰에서 여러 번 피펫팅한 후 배지를 흡입하여 흉선엽을 둘러싼 모든 세포를 제거합니다. 배지를 버리고 30μL의 완전한 배지를 추가합니다. 이 절차를 5-7회 반복하여 엽으로 이동하지 않는 여분의 미성숙 T 세포를 제거합니다. 그 후 매일 25–30μL의 배지를 교체하십시오.
  12. 광학 현미경으로 4-5일째부터 엽 주변에 iPSC 유래 흉선 이민자(iTE)의 후광 형성을 확인합니다.
  13. 엽 파괴 없이 배지를 파이펫팅하여 매일 iTE를 수집하십시오. 매일 미디어를 교체하고 최대 약 12일 동안 수집을 계속합니다.
  14. 수확된 iTE는 분자 분석(그림 1, 그림 2, 그림 3 및 그림 4) 또는 생체 내 이식 실험에 사용할 수 있습니다.

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결과

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그림 1: iPSC 유래 미성숙 T 세포가 파종된 흉선엽의 면역조직화학. 위: iPSC 유래 미성숙 T 세포의 파종을 유무에 관계없이 흉선엽의 H&E 염색. 두 번째 위에서 아래로: DAPI(핵), CD3(T 세포)로 염색되고 병합된 절편엽의 컨포칼 이미지. 스케일 바 = 100μm.

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그림 2: iTE는 흉선 후 T 세포 표현형을 보여줍니다. (A) 흉선세포, 흉선...

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공개 사항

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선언된 이해 상충이 없습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
2-데옥시구아노신시그마-알드리치312693-72-4
2-메르캅토에탄올(1,000개) 써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific21985-023
FBS(증권 시세 쌍둥이자리 100-500
Flt-3 리간드 R&D 시스템 427-플로리다
인터루킨-7 R&D 시스템 407 밀리리터
MEM 비필수 아미노산 용액지브코11140050
MEM 파우더지브코61100061
나트륨 피루브산 써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific제11360-070
줄기세포 인자(SCF) R&D 시스템 455-엠씨
페니실린/스트렙토마이신써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific15140-122
인산염 완충 식염수 pH 7.4 (1x)써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific제10010-023
RPMI 1640지브코11875093
10cm 접시코닝, Inc353003
Perfecta3D 행잉 드롭 플레이트 시그마-알드리치 HDP1096
집게듀몽0108-5PO
OP9/N-DLL1리켄 생물자원센터고양이# RCB2927; RRID:CVCL_B220
글루타맥스 (100배) 써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific제35050-061
) 년 표시기 명 ) 호 ) 년 ) 호 년 ) 호

재인쇄 및 허가

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허가 요청

태그

iPSC TdGUO3DCD8 TMHC IHalo Formation Assay

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