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인간 참가자와 관련된 모든 절차는 인간 복지를 위한 제도적, 국가적, 국제적 지침에 따라 수행되었으며 지역 기관 검토 위원회의 검토를 거쳤습니다.
1. 그림 1과 같이 간 조직에서 NK 세포 확장(0일차).
참고: 초기 세포 수와 생존율은 장기 제거 이후의 시간 및 초기 조직 샘플 양과 밀접한 상관관계가 있습니다. 그러나 조직을 30mL의 Hank's Balanced Salt Solution(HBSS)에 넣고 얼음이나 냉장고에서 4°C로 하룻밤 동안 보관하면 NK 세포는 최대 24시간 후에도 높은 순도와 생존력으로 증식할 수 있습니다.
- 멸균 수술 장비를 사용하여 조직 및 절편에서 림프구를 얻을 수 있는 생존 가능한 조직 영역을 식별합니다.
- HBSS 30mL(칼슘 또는 마그네슘 제외)에 조직을 넣고 분리할 준비가 될 때까지 얼음에 보관합니다.
- 멸균 면도날 또는 가위와 집게를 사용하여 조직을 생물 안전 캐비닛 안에 넣어 <0.5cm 입방체로 다집니다.
- HBSS(10x 콜라겐분해효소 IV: 10mg/mL 또는 ~200U/mL)에 10x 스톡을 희석하여 1x 콜라겐분해효소 IV 용액(1mg/mL)을 준비합니다.
- 다진 조직 조각을 조직 해리기 튜브에 넣습니다. 튜브에 4g 이하의 조직을 채우고 조직 조각을 ~10mL의 1x 콜라겐 분해 효소 IV에 담그십시오.
메모: DNase I을 사용하는 것은 NK 생존력과 수율을 약간 감소시킬 수 있으므로 권장되지 않습니다. 사용되는 특정 조직 해리기 튜브에 대해서는 재료 표를 참조하십시오.
- 조직 해리기 튜브를 조직 해리기에 넣고 37°C에서 블렌딩하여 조직을 완전히 다집니다.
메모: 간 조직의 경우 30분 이상 소요될 수 있습니다. 더 부서지기 쉬운 조직의 경우 약 15분으로 충분할 수 있습니다. 특정 조직 해리기 튜브와 사용되는 조직 해리기에 대해서는 재료 표를 참조하십시오.
- 조직 해리기 튜브를 제거하고 5mL 주사기의 백엔드를 사용하여 40μm 나일론 세포 여과기를 통해 분쇄합니다. 용리액을 수집하고 분해되지 않은 큰 단편을 버립니다.
- 실온에서 400 x g의 용리액을 5분 동안 스핀다운합니다. 상층액을 흡인합니다.
- 세포 펠릿을 30% 폴리비닐피롤리돈(PVP)으로 코팅된 실리카에 재현탁시켜 최종 림프구 분획을 오염시킬 수 있는 지방 세포를 제거합니다.
- 1x PVP 코팅 실리카를 준비하려면 10x PBS에 PVP 코팅 실리카를 9:1 희석하여 사용합니다.
메모: 사용된 특정 PVP 코팅 실리카에 대해서는 재료 표를 참조하십시오.
- 30% PVP 코팅 실리카를 준비하려면 1x PVP 코팅 실리카를 PBS/HBSS로 희석합니다.
- 세포 펠릿을 실온에서 400 x g에서 5분 동안 스핀다운합니다. 상층액을 흡인합니다.
- 세포 펠릿을 9mL의 R-10 media.
에 재현탁합니다.
메모: R-10 매체의 구성에 대해서는 재료 표를 참조하십시오.
- 4mL의 Ficoll 또는 림프구 분리 배지 위에 세포 현탁액을 조심스럽게 겹쳐 적혈구 및 다형성 핵 세포에서 림프구를 분리합니다.
- 400 x g에서 23분 동안 원심분리하여 실온에서 가속 및 브레이크를 끄거나 가장 낮은 설정에서 원심분리하여 층을 분리합니다. 상부 중간층을 조심스럽게 기울이고 조직에 침투하는 림프구를 포함하는 계면을 수확합니다.
- 10mL의 배지로 세포를 헹구고 세포 계수, 유세포 분석, 세포 분취 및 동결 또는 1차 NK 확장 프로토콜을 진행합니다.
