말초 혈액 단핵 세포에서 자연 살해 세포의 생체 외 확장

초록

출처: Ma, M., et al. Membrane Bound-IL-21-Modified B 세포주를 이용한 자연살해(NK) 및 CAR-NK 세포 증식 방법. J. Vis. 특급 (2022).

이 비디오는 피더 세포주를 사용하여 말초혈액 단핵세포(PBMC)에서 직접 자연살해(NK) 세포를 증식하는 기술을 보여줍니다. PBMC는 막결합 인터루킨-21(mIL-21)을 발현하는 유전자 변형 림프모세포 공급세포와 공동 배양되며, 배양액에는 사이토카인 인터루킨-2(IL-2) 및 인터루킨-15(IL-15)가 보충됩니다. 이 리간드의 칵테일은 함께 고순도의 NK 세포의 장기간 증식으로 이어집니다.

프로토콜

인간 참가자와 관련된 모든 절차는 인간 복지를 위한 제도적, 국가적, 국제적 지침에 따라 수행되었으며 지역 기관 검토 위원회의 검토를 거쳤습니다.

1. 그림 1과 같이 간 조직에서 NK 세포 확장(0일차).

참고: 초기 세포 수와 생존율은 장기 제거 이후의 시간 및 초기 조직 샘플 양과 밀접한 상관관계가 있습니다. 그러나 조직을 30mL의 Hank's Balanced Salt Solution(HBSS)에 넣고 얼음이나 냉장고에서 4°C로 하룻밤 동안 보관하면 NK 세포는 최대 24시간 후에도 높은 순도와 생존력으로 증식할 수 있습니다.

1. 멸균 수술 장비를 사용하여 조직 및 절편에서 림프구를 얻을 수 있는 생존 가능한 조직 영역을 식별합니다.
2. HBSS 30mL(칼슘 또는 마그네슘 제외)에 조직을 넣고 분리할 준비가 될 때까지 얼음에 보관합니다.
3. 멸균 면도날 또는 가위와 집게를 사용하여 조직을 생물 안전 캐비닛 안에 넣어 <0.5cm 입방체로 다집니다.
4. HBSS(10x 콜라겐분해효소 IV: 10mg/mL 또는 ~200U/mL)에 10x 스톡을 희석하여 1x 콜라겐분....

결과

그림 1: 고형 인간 장기 샘플의 NK 세포 확장 다이어그램. 간단히 말해서, 얻어진 인간 간 샘플은 기계적 소화를 위해 작은 입방체로 다지게 됩니다. 그런 다음 해리된 세포는 PVP 코팅된 실리카와 림프구 분리 배지를 사용하여 분리됩니다. 또한 NK 셀은 그림 2에 설명된 확장 프로토콜을 사용하여 확장됩니다.

그림 2: PBMC에서 CAR-NK 세포 생성의 개략적 워크플로우. 간략하게, 221-mIL21 공급세포는 0일차에 IL-.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
6웰 G-REX 플레이트	윌슨 울프	80240엠	NK 세포 증식용
AF647 활용 AffiniPure F(ab')2 단편 염소 항인간 IgG(H+L)	잭슨 이뮤노리서치	Tel.: 109-606-088	유세포 분석용
콜라겐분해효소 IV	시그마	C4 - 22-1G	TIL 절연용
매체 동결 보존	코 닝	35-010-이력서	90%
성분 : 소 태아 세럼 (FBS)
매체 동결 보존	시그마	D2050	10%
성분: 디메틸 설폭사이드(DMSO)
gentleMACS C-튜브	밀테니 바이오텍	Tel.: 130-093-237	TIL 절연용
젠틀맥스 옥토	밀테니 바이오텍	견적	TIL 절연용
Hank's Balanced Salt Solution(HBSS - 칼슘 또는 마그네슘 없음)	써모피셔	14170120	TIL 절연용
인간 IL-15	페프로텍	200-15	NK 세포 증식용
인간 IL-2	페프로텍	200-02	NK 세포 증식용
방사선 조사된 221-mIL21 공급세포	Dongfang Liu 박사의 연구실에서 생성됨		cryopreserve 매체에서 동결
림프구 분리 배지	코 닝	25-072-CV	TIL 절연용
PE 안티 휴먼 CD3 클론 HIT3a	바이오레전드	300308	유세포 분석용
PE/Cy7 안티휴먼 CD56(NCAM) 클론 5.1H11	바이오레전드	362509	유세포 분석용
퍼콜	GE 헬스케어	17089101	TIL 절연용
말초혈액 단핵세포(PBMC)	뉴욕 혈액 센터		건강한 기증자의 혈장에서 분리, cryopreserve 배지에 동결
R-10 미디어	폭스바겐	45000-404
성분 : RPMI 1640
R-10 미디어	폭스바겐	45000-304	1%
성분: L-글루타민
R-10 미디어	폭스바겐	45000-652	1%
성분: 페니실린 스트렙토마이신
R-10 미디어	코 닝	35-010-이력서	10%
성분 : 소 태아 세럼 (FBS)
트리판 블루	코 닝	25-900-클뤼도	세포 계수의 경우

년 년 년 년 년