말초 혈액 단핵 세포에서 자연 살해 세포의 생체 외 확장

초록

출처: Ma, M., et al. Membrane Bound-IL-21-Modified B 세포주를 이용한 자연살해(NK) 및 CAR-NK 세포 증식 방법. J. Vis. 특급 (2022).

이 비디오는 피더 세포주를 사용하여 말초혈액 단핵세포(PBMC)에서 직접 자연살해(NK) 세포를 증식하는 기술을 보여줍니다. PBMC는 막결합 인터루킨-21(mIL-21)을 발현하는 유전자 변형 림프모세포 공급세포와 공동 배양되며, 배양액에는 사이토카인 인터루킨-2(IL-2) 및 인터루킨-15(IL-15)가 보충됩니다. 이 리간드의 칵테일은 함께 고순도의 NK 세포의 장기간 증식으로 이어집니다.

프로토콜

인간 참가자와 관련된 모든 절차는 인간 복지를 위한 제도적, 국가적, 국제적 지침에 따라 수행되었으며 지역 기관 검토 위원회의 검토를 거쳤습니다.

1. 그림 1과 같이 간 조직에서 NK 세포 확장(0일차).

참고: 초기 세포 수와 생존율은 장기 제거 이후의 시간 및 초기 조직 샘플 양과 밀접한 상관관계가 있습니다. 그러나 조직을 30mL의 Hank's Balanced Salt Solution(HBSS)에 넣고 얼음이나 냉장고에서 4°C로 하룻밤 동안 보관하면 NK 세포는 최대 24시간 후에도 높은 순도와 생존력으로 증식할 수 있습니다.

1. 멸균 수술 장비를 사용하여 조직 및 절편에서 림프구를 얻을 수 있는 생존 가능한 조직 영역을 식별합니다.
2. HBSS 30mL(칼슘 또는 마그네슘 제외)에 조직을 넣고 분리할 준비가 될 때까지 얼음에 보관합니다.
3. 멸균 면도날 또는 가위와 집게를 사용하여 조직을 생물 안전 캐비닛 안에 넣어 <0.5cm 입방체로 다집니다.
4. HBSS(10x 콜라겐분해효소 IV: 10mg/mL 또는 ~200U/mL)에 10x 스톡을 희석하여 1x 콜라겐분해효소 IV 용액(1mg/mL)을 준비합니다.
5. 다진 조직 조각을 조직 해리기 튜브에 넣습니다. 튜브에 4g 이하의 조직을 채우고 조직 조각을 ~10mL의 1x 콜라겐분해효소 IV.
   에 담그십시오. 메모: DNase I을 사용하는 것은 NK 생존력과 수율을 약간 감소시킬 수 있으므로 권장되지 않습니다. 사용되는 특정 조직 해리기 튜브에 대해서는 재료 표를 참조하십시오.
6. 조직 해리기 튜브를 조직 해리기에 넣고 37°C에서 블렌딩하여 조직을 철저히 다집니다.
   메모: 간 조직의 경우 30분 이상 소요될 수 있습니다. 더 부서지기 쉬운 조직의 경우 약 15분으로 충분할 수 있습니다. 특정 조직 해리기 튜브와 사용되는 조직 해리기에 대해서는 재료 표를 참조하십시오.
7. 조직 해리기 튜브를 제거하고 5mL 주사기의 백엔드를 사용하여 40μm 나일론 세포 여과기를 통해 분쇄합니다. 용리액을 수집하고 분해되지 않은 큰 단편을 버립니다.
8. 실온에서 400 x g의 용리액을 5분 동안 스핀다운합니다. 상층액을 흡인합니다.
9. 세포 펠릿을 30% 폴리비닐피롤리돈(PVP)으로 코팅된 실리카에 재현탁시켜 최종 림프구 분획을 오염시킬 수 있는 지방 세포를 제거합니다.
   1. 1x PVP 코팅 실리카를 준비하려면 10x PBS에 PVP 코팅 실리카를 9:1 희석< 사용합니다> 메모: 사용된 특정 PVP 코팅 실리카에 대해서는 재료 표를 참조하십시오.
   2. 30% PVP 코팅 실리카를 준비하려면 1x PVP 코팅 실리카를 PBS/HBSS로 희석합니다.
10. 세포 펠릿을 실온에서 400 x g에서 5분 동안 스핀다운합니다. 상층액을 흡인합니다.
11. 세포 펠릿을 9mL의 R-10 media.
    에 재현탁합니다. 메모: R-10 매체의 구성에 대해서는 재료 표를 참조하십시오
.
12. 4mL의 Ficoll 또는 림프구 분리 배지 위에 세포 현탁액을 조심스럽게 겹쳐 적혈구 및 다형성 핵 세포에서 림프구를 분리합니다.
13. 400 x g에서 23분 동안 원심분리하여 실온에서 가속 및 브레이크를 끄거나 가장 낮은 설정에서 원심분리하여 층을 분리합니다. 상부 중간층을 조심스럽게 기울이고 조직에 침투하는 림프구를 포함하는 계면을 수확합니다.
14. 10mL의 배지로 세포를 헹구고 세포 계수, 유세포 분석, 세포 분취 및 동결 또는 1차 NK 확장 프로토콜을 진행합니다.

2. 그림 2와 같이 PBMC(또는 CB 또는 장기 조직)에서 1차 NK 세포 확장(0일).

1. 얼어붙은 PBMC와 조사된 냉동된 피더 셀을 37°C 수조에서 해동합니다.
2. PBMC 및 100개의 감마선 조사(Gy-irradiated) 221-mIL-21 세포를 10mL의 R-10 배지를 사용하여 400 x g에서 5분 동안 원심분리하여 세척합니다.
3. 유세포 분석을 위해 PBMC 1 x 10⁶ 세포 저장.
   메모: 초기 NK cell 순도는 NK cell 확장률을 계산하는 데 중요한 요소입니다.
4. 1mL의 R-10 배지에 세포를 재현탁합니다. Trypan Blue를 사용하여 셀을 계산합니다.
5. PBMC의 5 x 10⁶ 세포를 특수 6-well 플레이트에 100 Gy-조사된 221-mIL-21 세포의 10 x 10⁶ 세포와 혼합합니다(재료 표 참조).
6. human IL-2(200 U/mL) 및 human IL-15(5 ng/mL)가 보충된 R-10 배지 30mL를 추가합니다(재료 표 참조).
7. 37 ° C에서 5 % CO₂로 특수 6-well 플레이트를 배양합니다.
8. 배지를 human IL-2(200 U/mL) 및 human IL-15(5 ng/mL)가 보충된 R-10 배지로 교체하여 3-4일마다 NK 세포를 유지합니다.
   메모: 각 매체 변경 시 추가 확장을 위해 웰당 20 x 10⁶ 셀 미만으로 유지합니다. 최상의 생존력을 위해 각 웰의 총 세포 수가 100 x 10⁶ 세포를 초과하지 않는지 확인하십시오.
9. 총 세포 수, 생존율을 기록하고 3-4일마다 유세포 분석을 수행하여 NK 세포 증식률을 계산합니다.

결과

그림 1: 고형 인간 장기 샘플의 NK 세포 확장 다이어그램. 간단히 말해서, 얻어진 인간 간 샘플은 기계적 소화를 위해 작은 입방체로 다지게 됩니다. 그런 다음 해리된 세포는 PVP 코팅된 실리카와 림프구 분리 배지를 사용하여 분리됩니다. 또한 NK 셀은 그림 2에 설명된 확장 프로토콜을 사용하여 확장됩니다.

그림 2: PBMC에서 CAR-NK 세포 생성의 개략적 워크플로우. 간략하게, 221-mIL21 공급세포는 0일차에 IL-...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
6웰 G-REX 플레이트	윌슨 울프	80240엠	NK 세포 증식용
AF647 활용 AffiniPure F(ab')2 단편 염소 항인간 IgG(H+L)	잭슨 이뮤노리서치	Tel.: 109-606-088	유세포 분석용
콜라겐분해효소 IV	시그마	C4 - 22-1G	TIL 절연용
매체 동결 보존	코 닝	35-010-이력서	90%
성분 : 소 태아 세럼 (FBS)
매체 동결 보존	시그마	D2050	10%
성분: 디메틸 설폭사이드(DMSO)
gentleMACS C-튜브	밀테니 바이오텍	Tel.: 130-093-237	TIL 절연용
젠틀맥스 옥토	밀테니 바이오텍	견적	TIL 절연용
Hank's Balanced Salt Solution(HBSS - 칼슘 또는 마그네슘 없음)	써모피셔	14170120	TIL 절연용
인간 IL-15	페프로텍	200-15	NK 세포 증식용
인간 IL-2	페프로텍	200-02	NK 세포 증식용
방사선 조사된 221-mIL21 공급세포	Dongfang Liu 박사의 연구실에서 생성됨		cryopreserve 매체에서 동결
림프구 분리 배지	코 닝	25-072-CV	TIL 절연용
PE 안티 휴먼 CD3 클론 HIT3a	바이오레전드	300308	유세포 분석용
PE/Cy7 안티휴먼 CD56(NCAM) 클론 5.1H11	바이오레전드	362509	유세포 분석용
퍼콜	GE 헬스케어	17089101	TIL 절연용
말초혈액 단핵세포(PBMC)	뉴욕 혈액 센터		건강한 기증자의 혈장에서 분리, cryopreserve 배지에 동결
R-10 미디어	폭스바겐	45000-404
성분 : RPMI 1640
R-10 미디어	폭스바겐	45000-304	1%
성분: L-글루타민
R-10 미디어	폭스바겐	45000-652	1%
성분: 페니실린 스트렙토마이신
R-10 미디어	코 닝	35-010-이력서	10%
성분 : 소 태아 세럼 (FBS)
트리판 블루	코 닝	25-900-클뤼도	세포 계수의 경우

년 년 년 년 년