보조 T 세포와 항원 제시 세포 사이의 면역학적 시냅스 형성

초록

출처: Bello-Gamboa, A. et al., 인간 면역학적 시냅스 이미징.J. Vis. 특급(2019년)

이 비디오는 형광 현미경을 사용하여 항원 제시 세포와 보조 T 림프구 사이의 면역학적 시냅스 형성에 대한 체외 연구를 보여줍니다. 보조 T 림프구의 T 세포 수용체는 항원 제시 세포의 항원-MHC-II 복합체와 상호 작용하여 면역학적 시냅스를 형성한 후 시냅스를 향한 분비 소포 이동이 이어지며, 이는 형광 현미경으로 시각화됩니다.

프로토콜

1. Raji 세포를 접착하기 위한 슬라이드 준비

1. 웰당 150μL의 피브로넥틴(100μg/mL)을 8개의 마이크로웰 챔버 슬라이드(플라스틱 하단 챔버 슬라이드)에 추가하고 37°C에서 30분에서 1시간 동안 배양합니다. 이 접착 기질은 Raji 세포를 웰 바닥에 결합하고(2단계), Jurkat 세포와 살아있는 접합체를 형성하고(4단계) 세포를 관찰하고, 타임 랩스로 현미경 캡처(6단계)를 가능하게 하며, 나중에 옵션인 파라포름알데히드(PFA) 고정과도 호환됩니다.
   참고: 아세톤 고정의 경우 아세톤이 플라스틱을 용해시키므로 피브로넥틴 대신 유리 바닥 챔버 슬라이드와 폴리-L-라이신(20μg/mL)을 사용하십시오. 8 마이크로웰 챔버 슬라이드(1 cm² 웰, 최대 부피 300 μL) 또는 이에 상응하는 형식은 유연하고 적절한 형식입니다.
2. 200μL 자동 피펫을 사용하여 피브로넥틴을 흡인하고 200μL의 PBS로 부드럽게 흔들어 2분 동안 각 웰을 세척합니다. 이 세척을 한 번 더 반복합니다. 챔버 슬라이드는 이 단계에서 PBS와 함께 4°C에서 1-2주 동안 보관할 수 있습니다.

2. 챔버 슬라이드에 대한 Raji 세포의 접착 및 7-amino-4-chloromethylcoumarin (CMAC) 라벨링

1. Raji 세포의 사전 배양 10mL를 15mL의 V-bottom 튜브로 옮깁니다. 잘 혼합하고 10μL를 사용하여 Neubauer 챔버 또는 이와 동등한 챔버의 세포를 계수합니다.
2. 나머지 세포를 300 x g에서 실온에서 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 흡인하고 버립니다.
3. 10⁶ cells/mL의 농도로 따뜻한 완전 배양 배지(10% FCS, 2mM 글루타민, 10mM HEPES, 100U/mL 페니실린 및 100μg/mL 스트렙토마이신이 보충된 RPMI 1640)에 세포 펠릿을 부드럽게 재현탁합니다. 아래 주어진 방정식을 사용하십시오.
   ([ ]_{초기 x} V_초기 = [ ]_최종 x V_최종), 여기서 [ ]_초기는 초기 세포 농도를 나타내고, V_초기 = 세포 현탁액의 초기 부피, [ ]_최종 = 최종 세포 농도, V_final = 세포 현탁액의 최종 부피를 나타냅니다.
   참고: 시작 배양의 세포 농도에 따라 필요한 것보다 더 많은 세포를 수집할 수 있지만 잠재적인 문제를 방지하기 위해 실험이 끝날 때까지 배양에 남아 있는 세포(37°C)를 유지하는 것이 중요합니다(2.6단계 참조).
4. Raji 세포를 라벨링하여 시냅스 접합체(synaptic conjugate)가 형성되는 동안 식별될 수 있도록 합니다. 이 실험에서는 2.4.2단계에서 7-아미노-4-클로로메틸쿠마린(CMAC) 라벨링을 수행합니다.
   1. 배양 배지에서 필요한 수의 Raji 세포를 2mL 튜브로 옮깁니다. 8개의 마이크로웰 챔버 슬라이드의 경우 총 1.6mL의 세포 현탁액이 필요합니다(웰당 200μL).
   2. CMAC를 최종 농도 10μM에 추가합니다. CMAC는 빛에 민감하므로 튜브를 알루미늄 호일로 덮어 세포를 어두운 곳에 두십시오. 1cm²웰당 2 x 10⁵개의 Raji 세포를 포함하는 200μL가 필요합니다. 따라서 8개의 웰을 준비해야 하는 경우 1.6 x 10⁶ Raji 셀이 필요합니다.
      참고: 세포 추적기 파란색(CMAC, UV excitation 및 blue emission)으로 Raji 세포를 라벨링하면 시냅스 접합체가 형성될 때 Th 세포와 구별됩니다. 이 염료는 PFA 및 아세톤 고정제와 호환되며 추가 면역 형광 시술을 가능하게 합니다. 가벼운 노출을 피하십시오. CMAC로 풀에서 Raji 세포를 라벨링한 후 Raji 세포가 피브로넥틴으로 코팅된 챔버 슬라이드에 접착하기 전에 재부유하면 서로 다른 웰 간에 CMAC로 Raji 세포의 균일한 라벨링이 보장됩니다.
5. CMAC-염색된 세포를 재현탁하고, 1.2단계에서 챔버 슬라이드에서 PBS를 흡인한 후, 200μL의 세포 현탁액을 1.1-1.2단계에서 제조된 피브로넥틴 코팅된 챔버 슬라이드의 각 웰로 옮깁니다. 챔버 슬라이드를 37 ° C, 5 % CO₂에서 30 분-1 시간 동안 배양합니다.
   참고: 이 단계에서 접착 및 CMAC 라벨링이 동시에 발생하므로 시간이 절약됩니다. Raji 세포는 빠르게 침전되므로 시딩 전에 세포 현탁액에서 균일한 농도를 유지하기 위해 주의해야 합니다. CMAC 세척은 2.7단계(라벨링된 Raji 세포가 이미 챔버 슬라이드에 부착된 경우)에서 더 쉽게 수행되기 때문에 이 단계에서 원심분리로 CMAC를 세척할 필요가 없습니다. CMAC는 세포 현탁액에 과도하게 존재하기 때문에 청색 형광 배경이 너무 높아 청색으로 염색된 세포를 구별할 수 없습니다. CMAC 세척 후 2.7단계에서 세포 CMAC 형광을 확인합니다.
6. Raji 세포가 현미경의 챔버 슬라이드를 부드럽게 흔들어 웰 바닥에 부착되었는지 확인합니다. 셀이 서로 간에 간격을 표시하고 합류하지 않는지 확인합니다(그림 1, 중간 패널). 세포 합류의 50-60%가 적절합니다.
   1. 대부분의 세포가 챔버 슬라이드에 효율적으로 부착되고 세포 갭이 관찰되지 않는 경우, 따뜻하고 완전한 배지로 각 웰을 세척하고 200μL 자동 피펫으로 배지를 재현탁하여 과도한 세포를 분리합니다. 각 재부유 단계 후에 합류점을 확인합니다.
   2. 세포가 부착되지 않으면 접착 단계를 다시 반복하고 접착 시간 및/또는 세포 수를 늘리십시오.
      참고: 여기서 멈추고 챔버 슬라이드를 37°C, 5% CO₂에서 밤새 배양(O/N)하고 다음 날 프로토콜을 계속할 수 있습니다. 다음날 형광 현미경을 사용하여 Raji 세포가 부착되어 있고 CMAC 표지가 되어 있는지 확인하십시오.
7. 과도한 CMAC를 제거하고 형광 현미경으로 청색 방출을 확인하기 위해 따뜻한 RPMI로 각 웰을 다시 조심스럽게 세척합니다(그림 1).
   참고: 이멀젼 오일(끈적거리고 점성이 있는) 오일과 높은 개구수 오일 대물렌즈의 사용을 피하기 위해 초장거리(즉, 20x 또는 40x) 대물렌즈를 사용하여 형광 현미경을 사용하여 CMAC 라벨링을 빠르게 확인할 수 있습니다.

3. CMAC의 펄스 — 포도상구균 장독소 E가 있는 표지된 라지 세포

1. 각 웰에 포도상구균 장독소 E(SEE, 1μg/mL)를 추가합니다. SEE는 SEE 냉동 원료(PBS의 경우 1mg/mL)에서 세포 배양 배지(100μg/mL의 작업 용액)로 편리하게 희석할 수 있습니다. 200μL 마이크로웰당 100x 작업 용액 2μL를 사용합니다.
   주의: 이 단계에서는 장갑을 사용하고 사용한 팁은 생물학적 위험 상자에 넣어 폐기하십시오.
2. 챔버 슬라이드를 37°C, 5% CO₂에서 최소 30분 동안 배양합니다. SEE 효과는 최소 3-4시간 동안 지속됩니다.
   참고: 고유한 타임랩스 설정이 계획된 경우(5단계) 및/또는 종료점 실험의 시작 시점(6단계)에 따라 필요할 때 다른 시점의 우물에 SEE를 추가할 수 있습니다.

4. Jurkat 세포의 준비

1. 이 실험에는 이전에 성장한 Jurkat 세포(1-2 x 10,⁶ cells/mL) 배양액을 사용합니다. 표준 배양 플라스크 또는 앞서 설명한 바와 같이 표준 전기천공법 프로토콜에 따른 이전 transfection의 세포를 사용합니다. Jurkat 세포의 transfection을 통해 살아있는 세포에서 분비 과립의 이동을 타임 랩스로 시각화할 수 있습니다. 예를 들어, GFP-CD63(MVB의 마커)을 표현할 때 GFP-CD63으로 장식된 소포의 움직임을 기록할 수 있습니다.
2. 위상차 현미경으로 세포를 관찰합니다. 과도한 사멸 세포(>20-30%)가 관찰되는 경우, 사용하기 전에 과도한 사세포(사세포는 살아있는 세포보다 밀도가 높음)를 제거하기 위해 표준 프로토콜을 사용하여 Ficoll 밀도 구배 원심분리를 수행합니다(논의 참조).
3. 세포를 15mL 튜브, V-바닥 튜브로 옮기고 혈구계를 사용하여 계수하는 데 10μL를 사용합니다.
4. 2.2단계에서 설명한 대로 나머지 세포를 원심분리합니다. 상층액을 버리고 신선하고 따뜻한 배양 배지를 사용하여 Raji 세포와 동일한 농도(1 x 10⁶/mL)로 세포를 재현탁합니다. 2.2-2.3 단계를 수행합니다.
5. Step 4.
   를 기다리는 동안 Jurkat 세포를 배양(37°C, 5% CO₂)으로 유지합니다. 참고: 두 번째 옵션(transfection)에서는 살아있는 세포의 수가 첫 번째 옵션보다 훨씬 적을 것입니다. 따라서 실험에 충분한 세포를 확보하기 위해 더 높은 시작 세포 배양 부피를 사용하는 것이 좋습니다. 전기천공법 큐벳 및 형질주입당 10 x 10⁶ Jurkat 세포에서 2-4 x 10⁶ Jurkat 세포만 형질주입 48시간 후에 생존하며 이들 세포 중 일부는 Ficoll 단계 동안 소실됩니다. 따라서, 일반적으로 하나의 electroporation 큐벳은 8개의 마이크로웰(1.6 x 10⁶개의 transfected Jurkat 세포 필요)에서 부착된 SEE-pulsed Raji 세포에 챌린지를 수행하기에 충분합니다.

5. Raji와 Jurkat 세포의 공동 시딩

1. 3.2단계에서 CMAC 라벨링, SEE-펄스, 접착 Raji 세포가 포함된 챔버 슬라이드를 인큐베이터에서 꺼냅니다. CMAC는 이전에 2.7단계에서 수행되었으므로 이 단계에서 세척할 필요가 없습니다.
2. 자동 200μL 피펫을 사용하여 웰의 한쪽 모서리에서 각 웰의 배양 배지를 하나씩 조심스럽게 흡입합니다. 우물에 있는 매체가 완전히 건조되지 않도록 하십시오.
3. 단계 4.5에서 준비한 세포 배양 배지(1 x 10⁶/mL)에서 배지를 200μL의 재현탁된 Jurkat 세포로 즉시 교체합니다. 타임 랩스 이미징을 수행하는 경우 Jurkat 세포는 매우 빠르게 침전되어 시냅스 접합체를 형성하는 경향이 있으므로 이 단계 직후 6단계로 이동합니다. 편의상, 이 단계에서 Jurkat 세포와의 시딩을 받지 않는 SEE-pulsed, adeded Raji 세포를 포함하는 마이크로웰은 Jurkat 세포에 대한 후속 챌린지까지 세포 배양 배지로 유지해야 합니다. 이를 통해 Jurkat 세포에 대한 후속 도전을 통해 추가적인 타임 랩스 또는 역 동역학, 종말점 실험 접근 방식을 유연하게 수행할 수 있습니다.
4. 타임랩스를 수행하려는 경우 신속하게 6단계로 진행하십시오. 여기에는 현미경 스테이지 인큐베이터에서 1-2시간 동안 공동 배양이 포함되거나 37°C, 5% CO₂에서 이에 상응하는 배양을 통해 시냅스 접합체 형성 및 동시 이미지 획득이 가능합니다. 종말점 분석이 예상되지만 타임 랩스가 없을 것으로 예상되는 경우, 세포를 고정하기 전에 현미경(그림 1 참조)을 사용하여 공동 배양 기간 후 접합체 형성을 확인합니다.

6. 떠오르는 시냅스 접합체의 타임랩스 이미징

1. 이미징 전에 현미경과 배양 챔버를 준비합니다. 예를 들어, 자세한 현미경 설정은 그림 2.
   에 나와 있습니다. 참고: 타임 랩스 실험을 계획하고 있는 경우, Raji 세포가 부착된 챔버 슬라이드에 Jurkat 현탁액을 추가하기 전에 모든 현미경 설정 및 보완물(주변 세포 배양 챔버 등)을 준비해야 합니다. 다음 단계는 상업용 현미경에 대해 설명되어 있습니다(재료 표). 그러나 세포 배양 인큐베이터가 장착된 모든 도립 형광 현미경을 사용할 수 있습니다.
   1. 60x 오일 침지와 높은 개구수를 가진 현미경을 사용하여 편광 트래픽을 이미징할 수 있습니다.
   2. 자동 초점 시스템이 켜져 있는지 확인하고 오프셋을 조정하여 바닥 표면에 결합된 Raji 세포에 초점을 맞춥니다. 그림 1을 참조하십시오.
2. 5.3단계에서 부착된 Raji 세포를 포함하는 각 웰에 Jurkat을 추가한 후, 예열된(1-2시간) 현미경 스테이지 인큐베이터(즉, OKOlab)에서 마이크로웰 챔버 슬라이드를 빠르게 찾고 현미경으로 일부 XY 위치를 선택하며, 예를 들어 Jurkat-transfection된 세포가 현미경 초점으로 떨어지면서 발생하는 새로운 IS 형성을 기록할 가능성이 있는 필드를 선택합니다.
3. 온도 안정화 스테이지가 안정적인 X, Y, Z 위치를 유지하는 것으로 관찰되었으므로 예열된 현미경 스테이지 인큐베이터를 사용하십시오. 편리한 XY 필드의 기준은 초점이 잘 맞고 비융합 Raji 세포(즉, 세포 간의 갭 표시)와 형질 주입된 Jurkat 세포의 존재(투과율과 UV 또는 GFP 채널을 결합하여 확인할 수 있음)입니다. Jurkat 세포는 챔버 슬라이드에서 매우 빠르게(몇 분) 침전되며, 시간이 지남에 따라 새로운 시냅스를 이미지화할 수 있는 기회는 감소합니다(그림 1). 정의된 타임 랩스 후에 실험을 완료하거나 7단계로 진행하여 후속 면역형광 및 분석을 위해 접합체를 고정할 수 있습니다.
   참고: 적절한 시간 해상도(프레임당 1-2분)로 동시 다중 웰 타임 랩스 획득을 위해 최대 4개의 서로 다른 마이크로웰에서 최대 16개의 서로 다른 현미경 필드를 선택할 수 있습니다. 이 제한은 이미징할 다양한 형광 색소의 수와 강도(카메라 노출에 영향을 미침)에 따라 달라집니다(CMAC를 제외하고 발현된 형광 단백질의 수에 따라 다름). 프레임 속도를 높이는 한 가지 방법은 Raji 세포가 웰 바닥에 부착되어 Jurkat 세포처럼 쉽게 움직이지 않기 때문에 GFP에 대한 각 "n"개의 시간 프레임(즉, 그림 2와 같이 n = 8) 중 하나에서만 CMAC 채널을 기록하는 것입니다. 또한 잦은 자외선 노출은 세포를 손상시킬 수 있으므로 세포 생존력에 도움이 됩니다. MVB의 편광을 완료하는 데 몇 분에서 몇 시간이 걸리므로 시간 프레임 속도를 1분마다 1프레임 이하(즉, 프레임당 20초, 그림 2)로 조정해 보십시오. 이 다중 채널 캡처를 수행하려면 전동식 epi-fluorescence turret과 적절한 대역 통과 형광 필터 또는 이와 동등한 것이 장착된 현미경이 필요합니다.

결과

그림 1은 프로토콜(5.2단계)에 따라 얻은 시냅스 Jurkat-Raji 접합체를 나타냅니다. 이 이미지는 대표적인 타임랩스 실험의 첫 번째 프레임을 나타냅니다. 2 x 10⁵ Raji 세포 및 2 x 10⁵ Jurkat 세포를 1 cm² 웰에 첨가하였다. 상단 패널은 투과율 채널을, 중간 패널은 CMAC(청색) 채널(Raji 셀)로 구성되며, 하단 패널은 투과율과 CMAC 병합 채널을 모두 보여줍니다. 노란색 화살표는 일부 시냅스 접합체를 참조로 표시하는 반면, 녹색 화살표는 하나의 Jurkat 세포와 여러 개의 Raji 세포(복합 접합체)에 의해 만들어진 시냅스 접합체를 나타냅니다. 세포 농도가 감소하면(1cm²웰에서 10⁵

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
카메라 니콘 DS-QI1MC	니콘	MQA11550	냉각된 카메라 헤드
CMAC는	써모피셔 사이언티픽	C2110	셀 트래커 블루
JURKAT 세포	증권 시세	ATCC TIB-152	이펙터 T 림프구
μ-Slide 8웰 ibiTreat, μ-Slide 8웰 유리 바닥	이비디	Cat.No: 80826, 80827	세포 배양 및 세포 이미징 지원
현미경 NIKON Eclipse Ti-E	니콘	니콘 이클립스 Ti-E	광시야 형광, PFS(Perfect Focus System) 옵션이 장착된 완전 전동 현미경
3채널 수동 가스 혼합기 및 가스 버블러/습도 모듈이 있는 현미경 스테이지 인큐베이터	오콜랩	H201-니콘-TI-S-ER	세포 배양 분위기
라지 세포	증권 시세	ATCC CCL-86	APC (에이피씨)
RPMI 배지 GIBCO	써모피셔 사이언티픽	21875034	문화 매체
연쇄상구균 장독소 E (SEE)	톡신 테크놀로지, Inc	EP404	세균 독소
소프트웨어 이미지 J	국립보건원(NIH)	이미지 J	이미지 소프트웨어
소프트웨어: 니콘 NIS-AR	니콘	NIS-엘리먼트 AR	이미지 캡처 및 분석 소프트웨어