유세포 분석법을 통한 인간 사이토카인 유도 킬러 세포의 CD 마커 인식

초록

출처: Hsiao, C. H., et al. 암 치료를 위한 세포독성 사이토카인 유도 킬러 T 세포의 분리 및 확장. J. Vis. 특급 (2020년)

이 비디오에서는 말초 혈액 단핵 세포 배양에서 확장된 사이토카인 유도 킬러 T 세포, CIK 세포의 비율을 결정하기 위한 유세포 분석 기반 기술을 보여줍니다.

프로토콜

인간 참가자와 관련된 모든 절차는 인간 복지를 위한 제도적, 국가적, 국제적 지침에 따라 수행되었으며 지역 기관 검토 위원회의 검토를 거쳤습니다.

1. CIK 유도 및 확장

1. 0일차에 37°C 및 5% CO₂의 가습된 세포 배양 인큐베이터에서 24시간 동안 1,000IU/mL의 IFN-γ를 포함하는 신선한 기저 배지에서 PBMC(1 x 10⁶)를 배양합니다.
2. 1일차에 항-CD3 항체 50ng/mL, rh IL-1α 1ng/mL 및 rh IL-2 1,000U/mL를 함유한 새로운 기저 배지로 배지를 새로 고칩니다. 3일마다 매체를 새로 고칩니다.
3. 7일차에 1,000 U/mL의 rh IL-2를 함유한 새로운 기저 배지로 배지를 새로 고칩니다. 세포 확장이 끝날 때까지 3일마다 배지를 새로 고칩니다(14일차).

2. CIK 세포 평가를 위한 면역표현형 분석

1. CIK 세포를 10mL의 멸균 PBS로 세척합니다. 300 x g 및 18−20 °C에서 10분 동안 원심분리기를 하고 상층액을 흡입하고 10mL의 PBS로 세포를 재현탁합니다. trypan blue exclusion assay를 사용하여 세포 수와 세포 생존율을 계산합니다.
2. CIK 세포를 ~5–10 x 10⁵ cells/mL PBS의 밀도로 6개의 멸균 1.5mL 튜브로 분주합니다. 다음과 같이 라벨을 붙이고 처리하십시오 : 튜브 1, 블랭크 (항체 없음); 튜브 2, 20 μL의 동형 IgG1-FITC를 추가합니다. 튜브 3, 20 μL의 동형 IgG1-APC mAb를 추가합니다. 튜브 4, CD3-FITC의 20 μL를 추가합니다. 튜브 5, 20 μL의 CD56-APC mAb 추가; 및 튜브 6에 20μL의 CD3-FITC 및 20μL의 CD56-APC mAbs를 추가합니다.
3. 1mL 멸균 피펫으로 CIK 세포를 위아래로 3회 이상 부드럽게 피펫팅하여 항체와 부드럽게 혼합한 다음 어두운 곳에서 실온에서 30분 동안 배양합니다.
4. 300 x g 및 18−20 °C에서 10분 동안 튜브를 원심분리합니다.상등액을 흡입하고 PBS 1mL로 세포 펠렛을 한 번 현탁합니다. 1mL 멸균 피펫으로 최소 3회 위아래로 부드럽게 피펫팅합니다.
5. 2.4단계를 반복합니다.
6. 유세포 분석 전에 튜브를 어두운 곳에 두십시오.

3. CD 마커 인식

1. 캡을 통해 부드럽게 피펫팅하여 세포 여과기 캡(100μm 메쉬)이 있는 멸균 5mL 폴리스티렌 원형 바닥 튜브로 세포 현탁액을 옮깁니다. 캐러셀에 튜브를 순서대로 놓습니다.
2. 유세포 분석 소프트웨어를 열고 실험 폴더를 만듭니다. New Specimen 버튼을 클릭하여 실험에 표본과 튜브를 추가하고 튜브 이름을 다음과 같이 지정합니다. 튜브 2, 동형 IgG1-CD3; 튜브 3, 동형 IgG1-CD56; 튜브 4, CD3; 튜브 5, CD56; 튜브 6, CD3CD56.
3. CIK 세포 집단에 대한 산란 게이팅 시스템을 만듭니다(그림 1A).
   1. Tube 1 (Blank)을 선택하고 도트 플롯 버튼을 클릭하여 FSC-A/SSC-A 플롯을 생성합니다. 세포 파편을 제외하기 위해 FSC-A 임계값 > 5 x 10⁴로 전체 세포 집단에 대해 직사각형 게이트를 그립니다.
   2. 새 점도표에 대한 SSC-A/SSC-H 매개변수를 선택하고 모든 단일 셀 주위에 폴리곤 게이트를 그립니다. 새 히스토그램 플롯에 대해 Count/FITC(CD3) 및 Count/APC(CD56) 파라미터를 각각 선택합니다. 새 점도표에 대한 FITC(CD3)/APC(CD56) 매개변수를 선택하고 4개의 사분면 게이트를 그려 4개의 하위 모집단을 정의합니다.
   3. 각 표본에 있는 20,000개의 단일 세포에서 데이터를 기록합니다. Load Sample 버튼을 클릭하여 Blank control 샘플을 먼저 분석합니다. CD56 및 CD3 채널 파라미터를 사용하여 전체 CIK 세포 집단을 식별합니다.
4. 모든 표본을 조사하기 위해 3.3단계를 반복합니다.
5. 개별 검체의 통계적 값이 포함된 파일을 열어 CIK 세포 집단을 분석하고 분석 파일로 다시 인쇄합니다.

결과

그림 1: 대표적인 PBMC 샘플에서 CD3⁺CD56⁺ T 세포의 비율.(A) 림프구는 특정 크기와 입도에 의해 인식되었습니다. 유세포분석법을 통한 분석을 위해 선택된 단일 세포 집단. (B) 3명의 건강한 기증자로부터 CIK 확장 효능에 대한 통계적 분석을 t-테스트(*, p < 0.01)를 사용하여 수행했습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
APC Mouse Anti-Human CD56 항체	BD (영어)	555518	나159
APC 마우스 IgG1, κ 아이소타입 컨트롤	BD (영어)	555751	MOPC-21
BD FACSCanto II 유세포 분석기	BD (영어)	338962	SN: R33896202856
둘베코의 개조된 독수리 미디엄/F12	하이클론	SH30023.02	OC-3 세포 배양을 위한 기초 배지
소 태아 세럼	하이클론	SH30084.03	K562 및 OC-3 세포 배양용. 완전 배지에는 FBS의 10%가 포함되어 있습니다.
Ficoll-Paque 플러스	GE 헬스케어 생명과학	71101700-EK	밀도 구배 용액
FITC Mouse Anti-Human CD3 항체	BD (영어)	555332	우흐트1
FITC 마우스 IgG1, κ 아이소타입 제어	BD (영어)	555748	MOPC-21
인간 anti-CD3 mAb	타카라	T210	OKT3 2.5mL의 스톡(1mg/1mL)을 50mL의 인덕션 배지에 추가합니다. -80 °C에서 보관 재고
RPMI1640 매체	지브코	11875-085	K562 세포 배양을 위한 기초 배지. 4 °C에서 보관 재고

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