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동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.
1. 마우스에서 항원 특이적 CD8+ T 세포의 입양 전달
- 제조 지침에 따라 마우스 CD8+ T 세포 분리 키트를 사용하여 T 세포 수용체 형질전환 마우스의 림프절 현탁액에서 녹색 형광 단백질(OTI-GFP) 또는 적색 형광 단백질(OTI-RFP)을 발현하는 오브알부민(OVA) 특이적 CD8+ T 세포(OTI)를 분리합니다. 앞서 설명한 바와 같이 주사기 플런저를 사용하여 림프절을 부수어 세포 현탁액을 준비합니다.
- Cahalan 등에 의해 정맥 주사를 통해 OTI-GFP 또는 OTI-RFP 세포(3 x 106 세포)를 C57BL/6 야생형 마우스 수용자로 이식합니다. 일반적으로 6-12주 령의 마우스를 사용합니다.
메모: 이 단계는 선택 사항이며 항원 특이적 CD8+ T 세포를 추적하는 데만 필요합니다.
2. 리스테리아 모노사이토제네스 감염
- 앞서 설명한 바와 같이 OD600이 0.08–0.1에 도달할 때까지 부드러운 교반 하에서 37°C에서 배물 심장 주입에서 OVA(LM-OVA)를 발현하도록 유전적으로 변형된 L. monocytogenes를 확장합니다.
- 29G 인슐린 주사기를 사용하여 인산염 완충 식염수(PBS)에 희석된 0.1–0.5 LD50 LM-OVA 100μL(최대 부피 = 200μL)를 OTI-GFP 또는 OTI-RFP 세포가 있는 C57BL/6 야생형 마우스에 주입합니다><(지시된 경우).
메모: 우리 손에서 0.1 x LD50 LM-OVA는 2 x 104 집락 형성 단위(CFU)에 해당합니다. OVA를 발현하도록 유전적으로 변형된 L. monocytogenes는 이전에 전달된 OTI CD8+ T 세포를 활성화하는 데 사용되지만 L. monocytogenes의 다른 균주를 사용할 수 있습니다.
3. 사이토카인 분비를 차단하기 위한 Brefeldin A(BFA) 치료
- 29G 인슐린 주사기를 사용하여 마우스 희생 6시간 전에 복강내 200μL에 BFA 250μg을 주입합니다.
메모: 동결건조된 BFA는 먼저 디메틸설폭사이드(DMSO)에 재현탁하여 25mg/mL 농도의 스톡을 준비합니다. 그런 다음 BFA를 실온(RT)에서 PBS에 희석하여 주입 전에 결정화를 방지합니다. 사이토카인 분비의 억제는 세포에 IFNγ의 축적을 유도한다. 이는 사이토카인 검출에 매우 중요합니다.
4. 비장 수확
- CO2 농도 상승 후 자궁 경부 탈구를 사용하여 마우스를 안락사시킵니다.
메모: 생쥐의 인도적 안락사에 대한 지역 기관 지침을 따르십시오.
- 70 % 에탄올로 복부를 청소하고 가위로 절개하여 비장이있는 마우스의 왼쪽 옆구리에있는 피부를 1-2cm 정도 자릅니다. 복막을 조심스럽게 절개하여 비장이 드러나도록 하고 핀셋으로 빼냅니다. 비장을 채취하되 비장 구조를 방해하지 않도록 집게로 짜거나 자르지 않도록 주의하십시오.
5. 파라포름알데히드(PFA)로 비장 고정
- PBS 3.75mL와 0.2M L-라이신 3.75mL를 혼합하여 정착액을 준비합니다. m-오디에이트나트륨 21 mg을 넣고 잘 섞는다. 그런 다음 2.5mL의 4% PFA와 20μL의 12N NaOH.
를 추가합니다.
메모: 같은 날 정착액을 사용하고 초과분은 버리십시오. 보관하지 마십시오. 이 고정 단계는 샘플에 GFP와 같은 형광 단백질이 포함되어 있는 경우 중요합니다. 미량의 메탄올이 함유된 PFA는 형광 단백질을 변성시키므로 사용하지 마십시오.
주의: PFA는 독성이 있으므로 주의해서 다루어야 합니다.
- 비장을 고정제에 담그고 최소 4시간, 일반적으로 4°C에서 16-20시간 동안 부드럽게 교반하여 고정합니다.
- 정착액을 버리고 부드러운 교반 하에서 RT에서 5분 동안 PBS 5mL를 추가합니다.
- PBS를 5mL의 새 PBS로 교체하고 부드러운 교반 하에서 4°C에서 1시간 동안 배양합니다.
- PBS를 30% 자당 5mL로 교체하고 12–24 h.
동안 배양합니다.
메모: 이 방법은 조직 형태를 유지하는 데 도움이 됩니다. 자당 용액으로 배양 한 후, 기관은 우물 바닥에 가라 앉아야합니다.
6. 동결 및 단면화
- 드라이아이스를 큰 용기에 넣고 그 안에 약 50mL의 순수 메탄올과 드라이아이스 몇 조각이 들어 있는 작은 용기를 넣습니다.
- 보푸라기가 없는 물티슈로 비장을 부드럽게 말리십시오.
- 바닥에 최적 절단 온도(OCT) 화합물 한 방울이 들어 있는 기본 금형 내부에 비장을 놓습니다. 거품이 생기지 않도록 주의하세요. 비장에 OCT를 추가합니다.
- 집게를 사용하여 기본 곰팡이를 메탄올 표면에 놓고 OCT에 닿지 않도록 합니다. 인공물을 최소화하기 위해 가능한 한 빨리 조직을 동결합니다.
- 동결되면 sectioning.
를 진행합니다.
메모: 얼어붙은 비장은 몇 달 동안 -80 °C에서 유지할 수 있습니다.
- 극저온 마이크로톰을 사용하여 조직을 절단합니다.
- 저온 유지 장치의 챔버 온도를 -21°C로 설정합니다. 원하는 두께(보통 약 10μm)의 단면을 절단합니다. 이 프로토콜은 최대 30μm의 두께에서 작동합니다.
- 유리 현미경 슬라이드에 절편을 수집하고(재료 표 참조) 육안으로 검사합니다.
메모: 섹션은 몇 달 동안 -80 ° C에서 유지 될 수 있습니다.
7. 면역형광 염색
- 섹션이 RT로 오도록 허용합니다.
- 조직 섹션 주위에 액체 차단제(예: PAP 펜)로 원을 그립니다. OCT 바깥쪽으로 그리거나 붙지 않습니다.
- 건조되면 조직 섹션에 PBS를 5분 동안 올려
샘플을 재수화합니다.
메모: 섹션에 가해지는 부피는 섹션의 크기에 따라 다릅니다. 우리는 일반적으로 100–300 μL를 사용합니다. 재수화된 후에는 섹션을 건조시키지 마십시오.
- PBS로 최소 두 번 헹구어 섹션이 슬라이드에 잘 부착되었는지 확인하십시오.
- 항체의 비특이적 결합을 줄이기 위해 섹션에 차단 용액을 추가합니다.
- 0.1% Triton X100이 함유된 PBS, 2% 태아 송아지 혈청(FCS), 2.5μg/mL Fc 수용체 차단제(항마우스 CD16/32)와 같이 차단 용액을 준비합니다. 그런 다음 염색 패널의 각 2차 항체 종의 2–5% 정상 혈청을 추가합니다.
메모: 항체가 직접 접합/비오틴화되는 경우, 각 1차 항체 종의 정상 혈청 5%를 추가합니다. 1차 항체와 2차 항체 중 하나가 동일한 종(예: 토끼에서 사육된 1차 항체와 2차 토끼 항쥐에서 사육된 항체)에서 유래한 경우, 배경 신호를 증가시키므로 일반 혈청 종을 사용하지 마십시오.
- 흡인에 의해 섹션에서 PBS를 부드럽게 제거하고 샘플 섹션당 100μL의 차단 용액을 추가합니다. RT에서 최소 1시간 동안 덮개가 있는 습식 챔버에서 배양합니다.
- 1차 항체로 얼룩이 생깁니다.
- 1차 항체를 차단 용액의 최적 농도로 희석합니다. 일반적인 시작점 항체 농도는 5μg/mL이지만 각 항체 및 조직에 맞게 최적화되어야 합니다.
메모: 항체가 직접 접합된 경우 항체 혼합물을 17.135 x g (13.500 rpm)에서 4°C에서 15분 동안 원심분리한 후 사용합니다. 형광단은 침전될 수 있습니다. 이 단계는 침전물을 펠릿화하여 슬라이드에 침전된 항체의 비특이적 증착을 방지합니다.
- 차단 용액을 각 샘플에 대한 1차 항체 혼합물로 교체합니다.
- RT에서 4시간 동안 또는 4°C에서 하룻밤(OVN) 덮개가 있는 습식 챔버에서 배양합니다.
- 세탁을 수행합니다.
- PBS에 2% FCS를 첨가하여 세척 버퍼를 준비합니다.
- 세척 버퍼로 4회 세척: 1회(배양 없이), 1회는 10분, 2회는 5분. 그런 다음 PBS로 5분 동안 최종 세척을 수행합니다.
- 2차 항체로 염색.
- 관심 있는 2차 항체를 차단 용액의 최적 농도로 희석합니다. 1차 항체에 대해 설명된 대로 혼합물을 원심분리합니다.
- 최종 세척 용액을 제거합니다. 섹션 위에 2차 항체 혼합물을 추가하고 덮개가 있는 습식 챔버에서 RT에서 1-4시간 동안 배양합니다.
- 세척 버퍼로 4회 세척: 1회(배양 없이), 1회는 10분, 2회는 5분. 그런 다음 PBS로 5분 동안 최종 세척을 수행합니다.
- 최종 세척 용액을 제거합니다. PBS가 증발하도록 하되 섹션을 과도하게 건조시키지 마십시오. 샘플 위에 장착 매체 한 방울을 떨어뜨리고 그 위에 커버 유리를 조심스럽게 놓습니다. 장착 매체는 전체 섹션을 복구해야 합니다. 빛으로부터 보호된 RT에서 OVN을 중합효소로 만듭니다.
메모: 장착 매체를 적용하기 전에 슬라이드 뒷면에 있는 섹션 주위에 원을 그립니다. 장착 매체를 적용하면 조직이 보이기 어려워질 수 있습니다.
- 이미지가 준비될 때까지 4°C의 어두운 곳에 슬라이드를 보관하십시오.
8. 이미징 및 분석
- 컨포칼 현미경으로 염색 이미징을 수행합니다.
메모: 이 프로토콜에서는 도립 스펙트럼 레이저 스캐닝 현미경(재료 표 참조)과 대물렌즈 10x/NA 0.40 또는 60x/NA 1.4(사이토카인 세포 내 국소화 분석용)가 사용되었습니다. excitation 및 emission의 파장은 Table of Materials에 각 형광단과 형광 단백질에 대해 표시됩니다.
- 이미지 처리 소프트웨어(예: Imaris 또는 Fiji)를 사용하여 필요에 따라 분석 및 정량화를 수행합니다.