Murine Whole Blood에서 혈소판의 정화 및 활성화

초록

출처: Narciso, M. G., et al. 쥐의 혈액에서 혈소판 정제. J. Vis. 특급 (2019).

이 비디오에서는 쥐 전혈에서 혈소판을 정제하는 프로토콜과 혈소판 작용제인 트롬빈을 통한 후속 활성화에 대해 설명합니다. 유세포 분석으로 분석할 때, 정제된 휴면 혈소판은 세포 표면 마커 CD41의 발현을 기반으로 특성화되는 반면, 정제된 활성 혈소판은 표면 마커 CD41 및 CD62P를 모두 함께 발현합니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 혈소판 정제

참고: 혈소판 정화는 분해를 방지하기 위해 실온에서 수행해야 합니다. 시약과 기구의 온도가 18에서 22 °C 사이인지 확인하십시오. 혈소판 분해를 방지하기 위해 시술 중 빠른 피펫팅과 격렬한 흔들림을 피해야 합니다.

1. 600μL의 요오헥솔 구배 배지(0.85% 염화나트륨, 5mM 트리신, pH 7.2에 포함된 12% 요오헥솔 분말)를 1.5mL 튜브에 추가합니다.
2. 혈액과 요오헥솔 배지가 섞이지 않도록 넓은 구멍의 피펫 팁을 사용하여 구배 배지 상단의 튜브 측면을 따라 200μL의 혈액 샘플을 천천히 추가합니다(그림 1A).
3. 튜브가 포함된 시료를 400 x g에서 20°C에서 20분 동안 스윙 버킷 로터에서 느린 가속 및 감속으로 원심분리합니다.
4. RBC 및 WBC 층을 방해하지 않고 넓은 구경의 피펫 팁을 사용하여 혈소판이 풍부한 층의 대부분과 혈소판이 부족한 층의 작은 부분(총 300 - 400 μL)을 수집합니다(그림 1B). 혈소판 검체를 새 튜브로 옮깁니다.
   메모: 혈액 내 혈소판 수가 적거나 더 적은 양의 혈액을 사용하는 경우 혈소판이 풍부한 층과 혈소판이 부족한 층이 단일 층으로 보일 수 있습니다.
5. 혈소판 샘플에 PBS 1mL를 추가하고, 반전으로 혼합한 후 스윙 버킷 로터에서 20°C에서 10분 동안 800 x g으로 원심분리합니다. 용액을 완전히 버리고 PBS 200μL를 첨가하여 약한 피펫팅으로 혈소판을 재현탁합니다.
   메모: 이 단계는 구배 배지 및 혈장 단백질을 제거하고 트롬빈과 같은 작용제에 대한 혈소판의 민감도를 증가시키기 때문에 선택 사항입니다. 원심분리기마다 프로그램이 다르기 때문에 느린 가속/감속은 원심분리기의 사용 설명서를 읽고 결정할 수 있습니다.
6. 이 샘플 30μL를 새 튜브로 옮겨 혈소판 계수를 합니다. 나머지 혈소판은 혈소판 활성화, 응집, 과립 방출 등과 같은 생화학적 및 생리학적 분석에 사용할 수 있습니다.
7. RNA 또는 단백질 추출의 경우, 800 x g에서 10분 동안 혈소판 검체를 원심분리하여 혈소판을 펠릿화합니다. 펠릿을 방해하지 않고 상등액을 완전히 폐기하십시오. 원하는 부피의 RNA 또는 단백질 용해 완충액을 추가하여 혈소판을 용해합니다.

2. 혈소판 활성화

1. 튜브에 최대 100μL의 염색 완충액(2% 소 태아 혈청이 포함된 PBS, FBS)에 1-200만 개의 정제된 혈소판을 추가합니다.
2. 여러 샘플의 경우, 각각 PE-Cy7 rat anti-mouse TER 119, PE rat anti-mouse CD45, FITC rat anti-mouse CD41 및 APC rat anti-mouse/human CD62P(P-selectin) 중 1 μL(0.5 mg/mL)와 항체를 마스터 믹스하여 RBC, WBC, 혈소판 및 활성 혈소판을 검출합니다. 세포 염색을 위해 튜브에 마스터 믹스를 추가합니다. 트롬빈을 첨가하지 마십시오.
3. 다른 튜브에서 최대 100μL의 염색 완충액과 0.4mM GPRP 펩타이드에 1-200만 개의 정제된 혈소판을 추가합니다. 트롬빈을 추가하여 혈소판을 활성화하고 2.2.
   단계에 따라 세포를 염색합니다. 메모: 혈소판 활성화를 통한 응집체 또는 혈전 형성을 방지하기 위해 트롬빈을 추가하기 전에 GPRP를 샘플에 추가해야 합니다. 트롬빈 농도는 혈소판의 양호한 활성화를 얻기 위해 최적화되어야 합니다. 혈소판 활성화 후, 유세포 분석으로 샘플을 획득하는 동안 이벤트 수가 감소합니다.
4. 양성 대조군으로, 튜브의 최대 100μL 염색 완충액에 1μL의 전혈과 0.4mM GPRP 펩타이드를 첨가합니다. 트롬빈을 추가하여 혈소판을 활성화한다. 음성 대조군으로, 최대 100μL의 염색 완충액에 1μL의 전혈을 첨가합니다. 음성 대조군 샘플에 트롬빈을 첨가하지 마십시오. 2.2단계에 따라 셀을 염색합니다.
5. 유세포 분석 isotype control의 경우 stained, PE-Cy7, PE, FITC 및 APC가 있는 튜브 5개를 라벨링합니다. 표지된 튜브에 염색 완충액 100μL, 혈액 1μL, 항체 1μL를 추가하여 세포를 염색합니다.
6. 샘플을 배양하여 어두운 곳에서 실온에서 30분 동안 염색합니다.
7. 각 튜브에 1mL의 염색 완충액을 추가하여 샘플을 세척합니다. 800 x g의 원심분리기를 실온에서 5분간 사용합니다. 펠릿을 제거하지 않고 염색 완충액을 조심스럽게 폐기하십시오.
8. 각 튜브에 300μL의 염색 완충액을 추가하고 가볍게 혼합한 다음 FACS 튜브로 옮깁니다. 유세포 분석기로 분석할 때까지 염색된 샘플을 어두운 곳에 보관하십시오.

결과

그림 1. Iohexol gradient medium을 사용한 원심분리 전후 마우스 혈액. (A) 아이오헥솔과 혈액은 혈액 샘플을 조심스럽게 첨가하면 원심분리 전에 두 개의 별도 층을 형성합니다. 왼쪽 패널은 회로도를 보여주고 오른쪽 패널은 실제 이미지를 보여줍니다. (B) 4개의 분리되는 층은 기온변화도 매체를 가진 전혈의 원심분리 후에 보입니다. 왼쪽 패널은 레이어의 개략도를 보여주고 오른쪽 패널은 실제 이미지를 보여줍니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
APC 쥐 안티 마우스/인간 CD62P (P-셀렉틴)	열과학	Tel.: 17-0626-82	혈소판 활성화 마커
Eppendorf 튜브	피셔 사이언티픽	제14-222-166	원심분리기용 튜브
소 태아 혈청(FBS)	인비트로젠	26140079	염색 완충액 성분
FITC 쥐 안티 마우스 CD41	BD 바이오사이언스	553848	혈소판 마커
Gly-Pro-Arg-Pro(GPRP)	EMD 밀리포어	03-34-0001	혈소판 혈전 형성 방지
피펫 팁 1000 μL, 와이드 보어	써모피셔 사이언티픽	21-236-2씨	혈액 및 혈소판 샘플 이송
PE 쥐 안티 마우스 CD45	BD 바이오사이언스	561087	WBC 마커
PE-Cy7 쥐 안티 마우스 TER 119	BD 바이오사이언스	557853	적혈구 마커
피펫 팁 200 μL, 와이드 보어	써모피셔 사이언티픽	21-236-1ᄀ	혈액 및 혈소판 샘플 이송
인산염 완충 식염수(PBS)	써모피셔 사이언티픽	14040-117	세척 및 희석을 위한 완충제
염색 완충액	사내	카탈로그가 아닌 항목	세척 및 희석 완충액
트롬빈	효소 연구 연구소	HT 1002a	혈소판 활성화 작용제
소금	시그마-알드리치	S7653	생리식염수
탁상용 원심분리기	써모피셔 사이언티픽	75253839/433607	스윙 버킷 로터 원심분리기
트리신	시그마-알드리치	T0377	Nycodenz 매체용 버퍼
FACS 튜브	피셔 사이언티픽	352008	유세포 분석용 튜브

호 년