Isolation of Immune Regulatory Sertoli Cells from Mouse Seminiferous tubbules (쥐 정액 세뇨관에서 면역 조절 세르톨리 세포(Immune Regulatory Sertoli Cells) 분리

초록

출처: Bhushan, S. et al., 쥐 고환에서 Sertoli 세포 및 세뇨관 주위 세포 분리.J. Vis. 특급 (2016).

이 비디오는 고환의 구성 요소인 쥐 정세관에서 Sertoli 세포를 분리하는 절차를 보여줍니다. 효소 분해 및 반복 세척은 Sertoli 세포가 용액으로 방출되는 것을 촉진하며, 이는 증식 및 성장을 위해 추가로 배양될 수 있습니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 배지, 효소 용액 및 동물 준비

1. 에탄올 1ml에 요오드 1g을 용해시켜 100% 요오드 알코올을 준비합니다.
2. Ca²⁺ 및 Mg²⁺가 없는 2x 500ml Dulbecco의 인산염 완충 식염수(PBS)를 준비하고, 각각 7.5ml D-글루코스(100g/L) 및 5ml 100x 페니실린/스트렙토마이신 원액(15mg/ml D-글루코스, 50U/ml 페니실린 및 50μg/ml 스트렙토마이신 최종)을 보충합니다.
3. 5ml 100x 페니실린/스트렙토마이신 원액(50 U/ml 페니실린 및 50 μg/ml 스트렙토마이신 파이널)을 1x 500ml Roswell Park Memorial Institute(RPMI) 1640 배지로 보충합니다.
4. 9.9ml PBS에 25mg 트립신과 0.1ml DNase I(1mg/ml DNase I)를 첨가하여 Trypsin-DNase I 용액(2.5mg/ml Trypsin 및 10μg/ml DNase I)을 준비합니다.
5. 트립신 억제제 A 용액(10mg/ml)에 대해 5ml PBS에 50mg 트립신 억제제를 용해합니다. 트립신 억제제 B 용액(2.5mg/ml)에 대해 10ml PBS에 25mg 트립신 억제제를 용해합니다.
6. 콜라겐 분해 효소-히알루로니다제-데옥시리보뉴클레아제 I(DNase I) 용액의 경우 10mg 콜라겐분해효소 A(1mg/ml 최종), 10mg 히알루로니다아제(1mg/ml 최종) 및 0.1ml DNase I(1mg/ml DNase I)(10μg/ml 최종)을 10ml PBS에 용해합니다.
7. 9.9ml PBS에 10mg 히알루로니다아제(1mg/ml 최종) 및 0.1ml DNase I 용액(1mg/ml)(10μg/ml 최종)을 첨가하여 Hyaluronidase-DNase I 용액을 준비합니다.
8. Wistar 쥐를 Sertoli 세포 격리 당일 19일이 되도록 제 시간에 주문하십시오.
   메모: 설명된 프로토콜은 10마리의 랫트를 위해 설계되었지만 최소 5마리에서 최대 20마리의 랫트에 대해 수정할 수 있습니다. 모든 솔루션의 부피는 그에 따라 조정되어야 합니다.
   다음 프로토콜에서 "피펫"은 혈청학적 피펫을 나타냅니다.

2. 정립관의 준비

1. CO₂와 분당 챔버 부피의 최소 20%를 변위시키는 유속을 사용하여 건조기에서 10마리의 수컷 Wistar 쥐를 하나씩 마취합니다. 호흡이 멈출 때까지 기다렸다가 발 패드를 쥐어 마취를 테스트하고 반응이 없으면 경추 탈구로 각 쥐를 안락사시킵니다. 흐르는 물에서 경정맥과 경동맥(질 경동맥)을 절편하여 혈액을 배출합니다. 복부를 70% 에탄올로 닦아 소독합니다.
2. 겸자를 사용하여 복부 근육에서 피부를 들어 올리고 치골 교감에서 흉골까지 뻗어 있는 타원형 모양의 피부엽을 잘라내고(그림 1A) 가슴으로 위쪽으로 펄럭입니다. 다음으로 복부 근육을 잡고 치골 교감에서 흉골까지 내측 절개를 합니다.
   1. 골반에서 위쪽으로 엄지손가락으로 복부를 쥐어짜서 고환을 아래쪽 골반 밖으로 밀어냅니다. 고환을 더 끌어올리기 위해 집게가 있는 부고환 지방 패드(그림 1B)를 선택합니다. 정자를 자르고(그림 1B) 튜니카 알부기니아는 그대로 두고 50ml 원추형 튜브에 20ml PBS의 모든 고환을 수집합니다(그림 1C)
   .
3. 모든 고환을 채취한 후 에탄올에 20%(w/v) 요오드를 동일한 부피(1ml)로 첨가하여 고환을 소독합니다. 튜브를 두 번 뒤집고 상층액을 즉시 디캔팅합니다. 각각 25ml PBS로 고환을 두 번 빠르게 세척합니다(그림 1D).
4. 고환을 15ml PBS가 들어 있는 페트리 접시로 옮깁니다(그림 1E). 한쪽 끝을 집게로 각 고환을 단단히 잡고 반대쪽 끝에 있는 튜니카 알부기니아를 작게 절개한 다음 닫힌 가위 날을 긁는 도구로 사용하여 세뇨관을 짜냅니다.
   메모: 세뇨관은 여전히 균일한 효소 분해가 가능하도록 용액 안으로 확장되는 몇 개의 세뇨관만 있는 조밀한 고환 모양의 다발을 형성해야 합니다(그림 1F).
5. 캡슐화된 고환을 10ml Trypsin-DNase I 용액이 들어 있는 100ml 스크류 캡 병으로 옮깁니다. 32°C(120회/분)의 흔들리는 수조에서 분해를 수행합니다. 4분 후 세뇨관의 분산을 육안으로 평가합니다. 세뇨관이 용액으로 분산되기 시작하면 즉시 분해를 중단하십시오. 필요한 경우 최대 2분 동안 배양을 계속합니다.
6. 트립신 억제제 용액 5ml를 첨가하여 트립신 분해를 중지합니다. A. 10ml 피펫을 사용하여 3-4회 위아래로 피펫팅하여 용액을 철저히 혼합하고 50ml 원추형 튜브에 옮깁니다.
7. 배양 5분 후 단위 중력에 의해 세뇨관이 침전하는 것을 관찰하고, 2.6단계에서 10ml 피펫을 사용하여 상등액을 조심스럽게 제거하고, 트립신 분해를 완전히 중지하기 위해 10ml의 트립신 억제제 B 용액을 첨가합니다. 위아래로 2-3회 피펫팅하여 세뇨관을 다시 부유시킵니다.
8. 오염된 간질 세포를 제거하려면 세뇨관을 각각 25ml PBS로 9회 세척합니다. 25ml 피펫을 사용하여 세척할 때마다 세뇨관을 다시 현탁시키고 10분 동안 단위 중력에 의해 가라앉도록 합니다. PBS 피펫팅, 재현탁액 및 상층액 제거를 위해 항상 동일한 25ml 피펫을 사용하십시오.

3. 세뇨관 주위 세포(PTC)의 제거/격리

1. 모든 세뇨관을 100ml 나사 뚜껑 병에 옮기고 Collagenase-Hyaluronidase-DNase I 용액을 추가합니다(그림 2A). 32°C(120회/분)의 진탕에서 10분 동안 분해를 수행합니다.
2. 유리 슬라이드에 현탁액을 떨어뜨리고 100배 배율로 일상적인 세포 배양을 위해 도립 현미경으로 세뇨관을 빠르게 확인합니다. 분해가 충분히 진행되지 않으면 추가로 2분 동안 배양을 계속하십시오(현미경 검사에 필요한 시간은 계산하지 마십시오).
   메모: 이 단계에서 모든 세뇨관의 길이가 짧아지고 세뇨관 가장자리가 거칠어져야 합니다(그림 2B 및 C). 거친 가장자리는 세뇨관 주위 세포의 방출을 나타냅니다.
3. 2.8단계의 25ml 피펫을 사용하여 소화된 세뇨관이 있는 현탁액을 50ml 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 100ml 병을 10ml PBS로 씻고 원뿔형 튜브의 세뇨관에 추가합니다. 분해된 세뇨관이 단위 중력에 의해 10분 동안 침전되도록 하고 25ml 피펫을 다시 사용하여 PTC를 포함하는 상층액을 조심스럽게 흡인하고 새 원추형 튜브로 옮깁니다. 마지막 몇 밀리리터의 흡인을 위해 세뇨관의 전이를 방지하기 위해 5ml 피펫을 사용하십시오.

4. Sertoli 셀(SC)의 분리

1. 25ml 피펫을 사용하여 3.3단계에서 침전된 세뇨관을 25ml PBS에 완전히 재현탁하고 12분 동안 단위 중력에 의해 침전되도록 합니다. PBS 피펫팅, 세뇨관 재현탁 및 상층액 제거를 위해 동일한 25ml 피펫을 사용합니다. 세탁을 3회 반복합니다(총 4회 세탁).
2. 마지막 세척 후 소화된 세뇨관을 Hyaluronidase-DNase I 용액이 들어 있는 다른 100ml 나사 뚜껑 병으로 옮깁니다. 32°C(120회/분)의 흔들리는 수조에서 분해를 수행합니다.
3. 5분 후, 3.2단계에서 설명한 대로 100X 배율로 광학 현미경 검사로 세뇨관을 다시 확인합니다.
   메모: 짧은 세뇨관, 세뇨관 응집체 및 방출된 세포가 보여야 합니다(그림 2D).
   1. 관형 응집체가 10분 동안 가라앉을 때까지 기다린 후 25ml 피펫을 사용하여 상층액을 흡입합니다. 25ml PBS를 사용하여 골재를 4회 세척하고 각 세척 단계에 대해 10분의 침전 시간을 갖습니다(그림 2E).
4. RPMI 1640 배지 20ml를 넣고 20ml 주사기에 장착된 18G 바늘에 현탁액을 10회 통과시킵니다. 기포를 피하십시오.
   메모: 바늘을 통해 서스펜션을 안팎으로 당기는 것은 한 번의 통과로 간주됩니다. 유체역학적 전단에 의한 세포의 파괴 및 균질화는 응집되는 경향이 있는 세포를 준비하는 표준 기술입니다. 내경이 작은 피하 주사 바늘을 통해 세포를 통과하는 것은 세포의 기능적 특성에 영향을 미치지 않을 것입니다. 그림 3C 및 D는 배양 4일차에 정제된 Sertoli 세포의 정상적인 미세 구조를 보여줍니다.
   1. 현탁액을 유리 슬라이드에 떨어뜨리고 응집체가 모두 분산된 경우 10X 배율에서 일상적인 세포 배양을 위해 도립 현미경으로 세뇨관을 빠르게 확인합니다(그림 2F). 여과액에서 순수한 단일 세포 현탁액을 얻기 위해 70μm 세포 스트레이너를 통해 세포 현탁액을 여과합니다.
5. 브레이크를 사용하지 않고 200 x g에서 4.4 단계의 여과액을 실온에서 10분 동안 원심분리합니다. 25ml 피펫을 사용하여 상등액을 조심스럽게 흡인하고 Sertoli 세포를 40ml RPMI 1640 배지(무혈청)에 재현탁합니다.
6. 100μl 세포 현탁액과 100μl의 Trypan Blue Stain을 혼합하고 Neubauer Improved 챔버로 세포 계수를 수행합니다. 계수 결과에 따라 세포 농도를 3 x 10⁶ cells/ml로 조정합니다. 6웰 플레이트에 웰당 1ml를 씨딩합니다(=1일차). 메모: 현탁액의 Sertoli 세포는 빠르게 침전되므로 피펫으로 세포 분취액을 채취하기 전에 매번 튜브를 짧게 흔들어야 합니다. 4일째까지 그들은 하층에 단단히 부착됩니다.

결과

그림 1. Wistar 쥐의 고환은 절제 및 캡슐화 해제됩니다.(A) 복막강은 본문에 기술된 바와 같이 세로 절개를 통해 개방됩니다. 별표(*)는 epidydimal fat pad를 나타냅니다. (B) 정자를 절단하여 고환을 제거하고 (C) 20ml PBS가 들어 있는 50ml 원뿔형 튜브에 수집합니다. 모든 고환이 채취되면 에탄올 중 1%(w/v) 요오드 20ml로 소독합니다. 요오드를 제거하기 위해 각각 25ml PBS로 두 번 빠르게 세척합니다. (D) 첫 번째 PBS 세척 후 고환. (E) 고환은 페트리 접시(오른쪽)로 옮겨지고, 본문에 설명된 대로 닫힌 가위 날(왼쪽)을 사용하여 열린 튜니카 알부기니아에서 정액 세뇨관을...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
코닝™ 셀 스트레이너 70 μm	코 닝	431751	화이트 색상
DAPI 마운트먼트 ProLong® Gold Antifade	생명 기술	P-36931
D-포도당	시그마	G8644	100g/L
Ca2+/Mg2+가 없는 둘베코의 PBS	지브코	제14190-094
DNase I	로슈	10104159001
소 고환에서 추출한 히알루로니다아제	시그마	H3506
페니실린(5,000 U/ml) 스트렙토마이신(5,000 μg/ml)	지브코	제15070-063	100x 솔루션
RPMI-1640	지브코	21875-034	300mg/L L-글루타민 함유
돼지 췌장에서 추출한 트립신	시그마	T5266
트리판 블루 스테인 (0.4%)	지브코	제15250-061
대두에서 추출한 트립신 억제제	시그마	T6522	Sigma 제품은 이전에 사용된 Roche의 BPTI(아프로티닌)보다 상당히 저렴합니다.
Wistar WU 쥐	찰스 리버	해당 사항 없음	실험 당일에 19일이 지나야 합니다.

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