인간 말초 혈액 단핵 세포에서 CD4+ Vδ1+ γδ T 세포의 선택적 분리

초록

출처: Welker, C., et al. 분리 및 생체 외 Vδ1⁺CD4⁺γδ T 세포의 배양, 흉외 αβT 세포 전구. J. Vis. 특급 (2015).

이 비디오는 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)에서 CD4⁺Vδ1⁺γδ T 세포의 저농도 집단을 자기 라벨링 기반으로 분리하는 프로토콜을 보여줍니다. FITC-conjugated anti-Vδ1 antibodys, magnetic anti-FITC microbeads 및 anti-CD4 antibody-coated superparamagnetic beads의 조합을 사용하여 CD4⁺Vδ1⁺ T cell은 PBMC 집단에서 성공적으로 정제될 수 있습니다.

프로토콜

인간 참가자와 관련된 모든 절차는 인간 복지를 위한 제도적, 국가적, 국제적 지침에 따라 수행되었으며 지역 기관 검토 위원회의 검토를 거쳤습니다.

1. Vδ1 T 세포의 분리

1. Vδ1 CD4 T 세포의 빈도를 결정하는 초기 FACS로 <1 x 10⁶개의 분리된 림프구를 취합니다.
   메모: 이 T-세포 개체의 개체군 크기는 개인마다 그리고 면역학적 상태에 따라 크게 다를 수 있습니다. 일반적으로 T 세포의 약 1%는 Vδ1⁺이고 Vδ1⁺ 세포의 약 1-5%는 CD4⁺입니다.
   1. 2% FCS와 5mM EDTA를 함유하는 PBS로 구성된 1ml FACS 완충액으로 세포를 희석합니다. 660 x g에서 2분 동안 원심분리기를 만들고 상층액을 디캔팅합니다. 약 100μl FACS 완충액의 환류 부피는 후속 염색에 충분합니다. FACS 염색의 특이성을 높이기 위해 RT에서 5분 동안 5μl Fc-Blocking 시약으로 세포를 간단히 와류
   로 배양하고 배양합니다.
   2. Fc 차단 시약을 제거하지 않고 인간 단클론 항체를 세포에 직접 추가합니다. Vδ1 (1:50), CD3 (1:50), CD4 (1:200), CD8 (1:200) 및 TCRαβ (1:25)에 대한 항체로 세포를 염색해야 합니다. 해당 면역글로불린 isotype을 사용하여 isotype control을 준비합니다. 어두운 곳에서 4°C에서 20분 동안 항체가 있는 세포를 배양합니다.
   3. 1ml FACS 완충액(2분 동안 원심분리, 660 x g에서 세포)으로 세포를 세척하고, 상층액을 디캔팅하고, 나머지 완충액 부피에서 FACS 획득을 진행합니다.
2. 12 분 동안 원심 분리에 의해 세포를 펠릿화하십시오; 300 g에; 8 °C. 상등액을 제거하고 1 x 10⁷ 세포 당 60 μl MACS 완충기에 있는 세포 펠릿을 refuse. 1 x 10⁷ 세포당 20μl Fc-Blocking 시약을 추가하고 4°C에서 5분 동안 배양합니다.
3. 1 x 10⁷ 세포당 10μl FITC-conjugated anti-human Vδ1 항체를 세포에 직접 추가합니다. 어둠 속에서 4 °C에서 12 분 동안 배양하십시오.
4. 14ml MACS 버퍼(12분 동안 원심분리기, 300g에서 8°C)를 사용하여 세포를 세척합니다. 상등액을 완전히 버리고 1x10⁷ 세포당 80μl MACS 완충액에 세포를 재현탁합니다.
5. 1-2 x 10⁵ 세포를 취하여 100μl FACS 버퍼에 희석하여 FACS 분석에 의한 라벨링 검증을 수행합니다. 이 단계에는 추가 첨가제가 필요하지 않습니다. Vδ1^- 및 Vδ1⁺ 셀의 밝기에 충분한 차이가 있는지 확인합니다. 그렇지 않은 경우 1.3단계와 1.4단계를 반복합니다.
6. 1 x 10⁷ 세포당 20 μl anti-FITC microbeads를 나머지 세포에 첨가하고 잘 섞은 후 4 °C의 어둠 속에서 15분 동안 배양합니다. 그 후, 최소 10ml MACS 버퍼(300 x g에서 12분 동안 원심분리, 8°C)를 사용하여 세포를 세척합니다.
7. 원심분리하는 동안 500μl MACS 완충액이 있는 자석에 배치된 예냉각된 자기 컬럼을 평형을 이룹니다.
8. 500μl MACS 버퍼에 세포를 재현탁하고(세포 수가 1 x 10⁸보다 높은 경우 그에 따라 이 부피를 확대) 세포를 컬럼에 조심스럽게 적용합니다. Vδ1^- 세포를 포함하는 플로우 스루를 수집합니다.
9. 500μl MACS 버퍼로 컬럼을 세 번 세척하고 동일한 튜브에서 플로우스루를 다시 수집합니다. 저장소에 버퍼를 컬럼에 적용하기 전에 비어 있어야 합니다.
10. 자기 장치에서 컬럼을 제거하고 15ml 원추형 튜브에 넣습니다. 플런저를 컬럼에 단단히 밀어 넣어 1ml MACS 버퍼로 컬럼을 빠르게 플러시합니다. 튜브에 용리액을 수집합니다.
    참고: >98%의 순도를 얻으려면 일반적으로 두 번째 열로 1.7-1.9 단계를 반복해야 합니다.
11. 이전과 동일한 항체 패널(1.1.2 참조)로 FACS 분석을 통해 세포의 순도를 확인하고 세포를 계수합니다.

2. Vδ1CD4⁺ T 세포의 분리

1. 25μl의 CD4 비드를 >30초 동안 와류로 재현탁합니다. 튜브를 1분 동안 자석에 넣어 1.5ml 반응 튜브의 1ml MACS 버퍼에 비드(제조업체가 표시한 최소 양)를 세척합니다. 소량의 피펫(200μl)으로 상등액을 조심스럽게 폐기하고 MACS 버퍼의 원래 부피에 비드를 재현탁합니다.
2. Vδ1⁺ 세포를 펠릿화하고(12분 동안 원심분리, 300 x g에서 진행) 상층액을 흡인하고 모든 Vδ1⁺ 세포를 500μl MACS 완충액에 재현탁시킨 후 비드가 들어 있는 튜브에 추가합니다. 격렬하게 혼합하고 4 °C에서 20분 동안 일정한 기울이기로 배양합니다(예: 로테이터에서).
3. 세포가 들어 있는 튜브를 자석에 2분 동안 놓고 뚜껑에 잔여물이 없는지 확인합니다.
   참고: CD4⁺ 셀은 마그네틱 비드를 결합하고 자석을 향하는 튜브 측면에 부착됩니다.
4. 튜브를 자기 장치 내부에 유지하면서 뚜껑을 조심스럽게 열고 CD4-Vδ1⁺ 세포가 포함된 상등액을 소규모 피펫을 사용하여 수집합니다. ^CD4-Vδ1+ 세포를 별도의 튜브에 넣고 이 튜브를 자석에 다시 넣어 모집단에서 CD4 세포 또는 비드가 남아 있을 수 없도록 합니다.
   1. CD4^- 세포를 5ml MACS 완충액(12분 동안 원심분리기, 300 x g)으로 세척하고 100μl 배지당¹ x 10 5 세포의 농도로 재현탁합니다. CD4^- 세포는 적절한 조건에서 쉽게 배양 할 수 있습니다.
5. CD4⁺ 세포 표적이 있는 튜브를 자기장 외부에 놓고 세포를 500μl MACS 버퍼에 다시 현탁시킨 다음 자기 장치에 다시 넣습니다. 더 높은 순도를 얻으려면 2.3-2.5단계를 두 번 반복합니다. 피펫팅으로 상층액을 제거합니다.
6. CD4⁺ 세포를 100μl 배양 배지(RPMI 1640, 10% FCS, 1% L-글루타민, 1% 페니실린/스트렙토마이신)에 재현탁하고 10μl의 비드 분리 용액을 추가합니다. RT에서 45분 동안 지속적으로 기울이면서 배양합니다(예: 로테이터에서).
7. 세포를 자석에 1분 동안 넣고 소규모 피펫을 사용하여 bead-free Vδ1⁺CD4⁺ 세포가 포함된 상등액을 조심스럽게 수집합니다.
8. 자석 외부에서 100μl 배양 배지로 비드를 재현탁하고 2.6 및 2.7 단계를 두 번 반복하여 더 높은 수의 CD4⁺ 세포를 얻습니다.
9. 세포를 펠릿화하고(300 x g에서 12분 동안 원심분리) 피펫팅으로 상층액을 완전히 폐기합니다. 신선하고 예열된 배지에 세포를 재현탁하고 계수합니다. 1.1.1-1.1.3단계에 나타난 FACS 분석을 통해 Vδ1⁺CD4⁺ 세포의 순도를 검사합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
인산염 완충 식염수	시그마 알드리치	D8537
MACS 버퍼	밀테니 바이오텍	Tel.: 130-091-222	BSA를 보충하고 사용하기 전에 미리 식히십시오
증권 시세	밀테니 바이오텍	Tel.: 130-091-376	이 공급 업체로부터 의무적으로 허용되지 않음
항인간 Vd1 FITC (클론: TS8.2)	써모 사이언티픽(Thermo Scientific	TCR2730	이 공급 업체로부터 의무적으로 허용되지 않음
anti-human CD3 PerCP (클론: SK7)	BD 바이오사이언스	345766	이 공급 업체 또는이 형광 색소로부터 의무적으로 아닙니다
안티 휴먼 TCRab PE (클론 : T10B9.1A-31)	BD 바이오사이언스	555548	이 공급 업체 또는이 형광 색소로부터 의무적으로 아닙니다
안티 휴먼 CD4 VioBlue (클론 : MT466)	밀테니 바이오텍	Tel.: 130-097-333	이 공급 업체 또는이 형광 색소로부터 의무적으로 아닙니다
안티 휴먼 CD8 APC-H7 (클론 : SK1)	BD 바이오사이언스	641400	이 공급 업체 또는이 형광 색소로부터 의무적으로 아닙니다
Anti-FITC MultiSort 키트	밀테니 바이오텍	Tel.: 130-058-701	anti-FITC MicroBeads보다 더 나은 결과를 제공합니다.
MS 컬럼	밀테니 바이오텍	Tel.: 130-042-201	사용 전 사전 냉각
MiniMACS 분리기	밀테니 바이오텍	Tel.: 130-042-102
CD4 포지티브 절연 키트	생명 기술	11331디