인간 호중구 세포 외 트랩을 생성하는 In vitro 기술

초록

출처: Najmeh, S., et al. 단순화된 인간 호중구 세포 외 트랩(NET) 분리 및 처리. J. Vis. 특급 (2015년)

이 비디오는 호중구 세포 외 트랩(NET)을 생성하고 분리하는 시험관 기술을 보여줍니다. 호중구는 말초 혈액에서 분리되고 phorbol myristate acetate (PMA)로 자극되어 NET을 생성합니다. 배양 과정에서 호중구는 세포 사멸 과정(NETosis)을 거쳐 과립 세포질 단백질과 혼합된 응축된 염색질로 구성된 NET을 방출합니다.

프로토콜

인간 참가자와 관련된 모든 절차는 인간 복지를 위한 제도적, 국가적, 국제적 지침에 따라 수행되었으며 지역 기관 검토 위원회의 검토를 거쳤습니다.

1. NET 생성

1. 500nM의 PMA(호중구 용액 30ml당)로 호중구를 자극하고 37°C, 5% CO₂에서 4시간 동안 20mm 그리드의 150 x 25mm 편평한 조직 배양 접시에서 배양합니다. 이렇게 하면 NETosis가 허용됩니다.
2. 4시간 동안 자극을 가한 후 부드럽게 흡인하고 매체를 버리고 그물층과 호중구층이 바닥에 부착된 상태로 둡니다. 이 계층을 중단하지 마십시오.
3. 접시당 Ca와 Mg가 없는 총 15ml의 차가운 PBS를 사용하여 접시 바닥에 PBS 15ml를 피펫팅하여 바닥에서 모든 접착 물질을 들어 올려 각 접시의 바닥을 씻습니다.
4. 각 접시를 세척하여 얻은 용액을 15ml 원뿔형 튜브에 넣고 4°C에서 450 x g로 10분 동안 원심분리합니다. 호중구와 나머지 세포는 바닥에서 펠릿화되어 세포가 없는 그물이 풍부한 상층액을 남깁니다.
5. 상층액을 1.5ml 마이크로 원심분리 튜브로 나누고 4°C에서 18,000 x g로 10분 동안 회전합니다. 이렇게 하면 모든 DNA가 pellet.
   메모: 더 큰 튜브의 원심분리는 일반 원심분리기에서 이러한 높은 속도를 달성할 수 있는 경우 더 쉽고 시간이 덜 소요되며, 그렇지 않으면 고속 마이크로 원심분리기를 사용하기 위해 상층액을 더 작은 튜브로 분할해야 합니다.
6. 상등액을 버리고 얼음처럼 차가운 PBS에서 함께 얻은 모든 펠릿을 PBS 100μl당² x 10 7 호중구에 해당하는 농도로 재현탁합니다. 이렇게 하면 후속 실험에 사용할 수 있는 cell-free NET stock을 얻을 수 있습니다.
7. 분광 광도법 또는 대체 DNA 정량 도구를 사용하여 얻은 샘플의 DNA 농도를 측정합니다. 샘플의 적절한 농도는 140 - 180ng/μl 사이여야 합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Dulbecco의 인산염 완충 식염수(PBS), 변형, 염화칼슘 및 염화마그네슘 없음	들소	311-425-CL
RPMI-1640 L-글루타민 함유 배지	들소	350-000-CL	3% RPMI 용액은 RPMI에 3% 소 태아 혈청을 보충하여 만듭니다
Phorbol 12- 미리 스테이트 13- 아세테이트 (PMA)	시그마-알드리치	P8139
소 태아 세럼(FBS)	들소	제080-150
20mm 그리드(150 x 25mm)의 Integrid 조직 배양 접시	송골매	353025

. (영문) 호