쥐 치아 블록에서 치은 면역 세포 네트워크 분리

초록

출처: Dutzan, N. et al., 치은 면역 세포 네트워크의 분리, 특성화 및 기능 검사. J. Vis. 특급 (2016)

이 비디오는 마우스 모델에서 치은 면역 세포 네트워크의 분리 절차를 보여줍니다. 효소 소화는 부착된 치아와 뼈에서 잇몸 조직을 방출하고, 이는 더 기계적으로 소화되어 치은에서 면역 세포를 방출합니다. 분리된 세포는 면역학 실험을 할 준비가 되었습니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 미리 준비하라

1. 완전한 배지 준비: 2mM L-글루타민, 100단위/ml 페니실린, 100ug/ml 스트렙토마이신 및 10% FBS가 보충된 RPMI.
2. DNase 배지 준비: 7.5μg DNase가 보충된 RPMI 배지 50ml(신선하게 만들고 항상 얼음에 보관).
3. 콜라겐 분해 효소 -DNase 배지 준비 : DNase 배지 5ml와 콜라겐 분해 효소 IV 유형 3.2 mg / ml (신선하게 만들고 항상 얼음에 보관하십시오).
4. 원심분리기를 4°C로 예냉각합니다.
5. 셰이커 인큐베이터를 37°C로 가열합니다.

2. 치은 블록으로부터의 분리, 해부 및 세포 분리

1. ARAC(Animal Research Advisory Committee) 지침에 따라 적절한 챔버에서 생쥐를 CO₂에 노출시켜 안락사시킵니다.
2. 흉강과 복강을 열어 심장과 내부 장기를 노출시킵니다. 관류하려면 하대정맥을 절개하고 27G 바늘이 있는 3ml 주사기를 사용하여 좌심실을 통해 PBS 3ml를 관류합니다.
3. 배가 위를 향하도록 패드에 마우스의 몸과 머리를 고정합니다.
4. 입술의 각 부위를 목 쪽으로 자르고, 하악골과 목 부위를 덮고 있는 피부를 분리하고, 그 밑에 있는 조직과 근육을 노출시킨다. 아랫입술을 절개하여 하악골을 드러냅니다.
5. 아래 앞니 사이를 잘라 하악골의 양쪽을 분리하고 구강에 접근하기 위해 양쪽을 움직이지 못하게 합니다.
6. 비강에서 멀리 떨어진 입천장을 시각화하고 해부합니다.
7. 10개의 블레이드를 사용하여 영역을 절개하고 주변 치은과 함께 상악 및 하악 어금니 영역을 포함합니다(그림 1). 첫 번째 어금니의 바로 앞쪽과 세 번째 어금니의 뒤쪽에 수직 절개를 하고 잇몸(치아를 둘러싼 조직의 흰색 고리)의 경계에 수평 절개를 합니다.
8. 상악 및 하악 블록을 50ml 콜라겐 분해 효소 / DNase와 함께 5ml 원뿔형 튜브에 놓습니다 (얼음에 보관).
9. 37°C의 쉐이커 인큐베이터에서 1시간 동안 배양하고 마지막 5분 동안 50μl의 0.5M EDTA를 추가합니다.
10. 티슈와 함께 50ml 튜브에 차가운 DNase 배지 5ml를 넣고 부드럽게 휘젓습니다.
11. 조직 4개 블록을 페트리 접시에 옮기고 500μl의 DNase 배지로 덮습니다. 메스 칼날을 사용하여 각 조직 블록에서 치은을 제거하고 칼날이 잇몸 및 치간 부위를 가리키
도록 합니다.
12. 페트리 접시의 조직과 배지를 해부 중에 사용된 이전 DNase 배지와 함께 세포 여과기(70μm 크기)를 통해 새 50ml 튜브로 옮깁니다. DNase 매체(3-5ml)로 사용된 모든 기구와 필터를 세척합니다.
13. 멸균 3ml 주사기의 플런저를 사용하여 조직을 스트레이너에 대고 으깨고 차가운 DNase 매체(30-35ml)로 여과합니다.
14. 세포 여과기를 차가운 DNase 배지로 세척합니다.
15. 4°C에서 314 x g에서 6분 동안 원심분리기
16. 상등액을 버리고 1ml의 완전한 배지에 다시 현탁시킵니다.
17. 자동화된 세포 계수기를 사용하여 세포를 계산합니다(예상 양은 8 x 10⁵에서 1.2 x 10⁶ 세포 사이여야 하며 생존력은 >80%)입니다.

결과

그림 1: 쥐 치은의 분리. 치은 조직 해부에 사용되는 상악골과 고립된 치은 분절의 해부 경계를 보여주는 그림. (B) 블록 해부를 위한 윤곽이 있는 쥐 상악골(어금니 면적)의 분절 및 고립된 블록. 치은 조직이 윤곽이 그려진 상악 어금니 분절의 헤마톡실린 및 에오신 염색(H&E)은 (D)에서 낮은(C) 및 높은 배율로 표시됩니다. 원본 배율이 표시되어 있습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
파인 가위	정밀 과학 도구	14058-11
메스 손잡이 #3	정밀 과학 도구	10003-12
메스 블레이드 #10	정밀 과학 도구	10010-00	메 마른
파편 집게	인테그라 밀텍스	6-304
규칙적인 베벨이 있는 바늘	(주)비디메디컬	305109	27G, 길이 12.7mm
Monoject 주사기	코비디엔	8881513934	루어락 팁, 3mL
PBS, pH 7.4	생명 기술	제10010-049	칼슘과 마그네슘 무함유
RPMI 1640	론자	12-167층	L-글루타민 무함유
소 췌장에서 추출한 DNase I	시그마-알드리치	DN25-1지
콜라겐분해효소 IV형	Gibco(Life Technologies 제공)	제17104-019
소 태아 세럼	제미니 바이오 제품	100-106
겐타마이신 50mg/ml	고품질 생물학	120-098-661EA
펜 스트렙	Gibco(Life Technologies 제공)	15140-122
L-글루타민	Gibco(Life Technologies 제공)	제25030-081
0.5M EDTA 산도 8.0	고품질 생물학	351-027-721EA
50 mL 튜브	코 닝	352070	폴리프로필렌, 멸균
70μM 세포 스트레이너	코 닝	352350
페트리 접시	코 닝	351029	메 마른

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