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동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.
1. 폐 조직 샘플
참고: 폐 조직에 대한 생체 내 연구의 경우 관련 노출 후 샘플을 연구하십시오. 이 실험과 가장 관련이 있는 노출은 감염성 미생물, 특히 박테리아입니다. 이 방법에 사용할 수 있는 마우스 균주는 C57BL/6 또는 BALB/c 마우스, 10 - 12주, 체중 25 - 30g 및 수컷입니다.
- 케타민(400mg/kg)과 자일라진(40mg/kg)의 복강내 주사를 통해 생쥐를 안락사시킵니다. 흉강을 열고 수술용 집게와 가위를 사용하여 폐와 심장을 노출시킵니다.
- 21게이지 바늘을 사용하여 따뜻한 PBS를 우심실에 주입하여 30초 동안 혈관에서 혈액을 씻어낸 다음 2% PLP 고정제 10mL를 30초 동안 (우심실로) 주입합니다.
- 따뜻한 PBS(42°C)를 사용하여 열린 흉강을 세척합니다. 21게이지 바늘과 크기에 맞게 자른 0.8mm 튜브 조각으로 기관을 삽관하고 예열된(42°C까지) 저융점 3% 아가로스 용액 800μL를 주입합니다.
- 꼰 실크(4.0 USP)로 기관을 묶습니다. 캐뉼라의 삽입 지점 바로 아래에 있는 기관 주위에 실을 놓고 간단한 오버핸드 매듭으로 고정합니다. 아가로스를 굳히려면 폐 주위에 얼음처럼 차가운 PBS를 투여합니다. 가위와 둔기 박리를 모두 사용하여 폐와 심장을 흉강에서 블록으로 제거합니다. 각 폐를 개별적으로 제거한 다음 4 °C에서 2 % PLP 또는 포르말린에 16 시간 동안 고정합니다.
- 조직 절편까지 4°C의 PBS에 검체를 보관하십시오.
- 폐 조직 샘플을 준비하려면 다음 단계를 사용하십시오.
- 폐 조직(1.1단계에서 절제)을 10% 천연 완충 포르말린에 실온에서 24시간 동안 고정합니다. 75% 에탄올로 옮기고 12시간 주기(75% EtOH에서 2.5시간, 절대 EtOH에서 3시간, 용매 3B에서 3.5시간, 파라핀에서 3시간)로 조직 처리기에 넣습니다.
- 표준 파라핀에 삽입하여 실온에서 보관되는 포르말린 고정, 파라핀 포매(FFPE) 블록을 생성합니다.
메모: 이 단계에서는 일반적으로 표준 슬라이드의 폐 부분을 절단하는 것이 편리합니다.
- 마이크로톰을 사용하여 FFPE 폐 부분을 4 - 5 μm 두께로 절단하고 충전되고 코팅된 슬라이드에 장착합니다.
- 슬라이드를 장착하려면 60mm x 24mm 커버슬립(크기 1.5)에 장착 매체 3방울을 떨어뜨리고 커버슬립의 슬라이드를 뒤집은 다음 초과 매체를 밀어냅니다. 매니큐어로 밀폐하고 실온에서 보관하십시오.
2. 폐 조직 샘플의 준비/현미경 검사
- 항원 회수 용액으로 FFPE 폐 조직 샘플을 탈왁스, 재수화 및 전처리합니다.
- FFPE 슬라이드를 60°C에서 60분 동안 오븐에서 건조합니다. 그런 다음 슬라이드를 크실렌 용액에 30분 동안 넣고 실온에서 5분 동안 70% 에탄올 용액으로 옮깁니다. 수돗물로 헹굽니다.
- 내열 플라스틱 랩에 넣고 압력솥에서 10m/mol/L Tris, 1mmol/EDTA pH 9.0에서 10분 동안 HIER 항원 회수를 실시합니다. 20분 동안 식힙니다. 로커에서 수돗물로 5분 동안 두 번 씻은 다음 로커에서 PBS로 한 번 씻습니다.
- 5% BSA/PBS 중 10% 치킨 세럼을 실온에서 30분 동안 차단합니다.
- 조직을 염색하십시오.
- 대식세포에서 MET를 정의하려면 1% BSA/PBS에 1차 항체(MMP-9, H3Cit 및 F4/80)를 4°C에서 1/100 희석으로 16시간 동안 추가합니다(항체 양에 대한 자세한 내용은 재료 표 참조). 로커에서 PBS로 5분 동안 두 번 씻습니다.
- 실온에서 40분 동안 1% BSA/PBS에 해당하는 2차 항체를 배양하여 형광 검출을 달성할 수 있습니다. 항체는 (1) chicken anti-mouse 488 (녹색), (2) chicken anti-goat 594 (빨간색), (3) 당나귀 anti-mouse 647 (원적색)입니다.
- PBS에서 절편을 세척하고 염색질 염색을 위해 DAPI 함유 장착 매체로 장착합니다.
- 도립 현미경에 부착된 컨포칼 레이저 스캐닝 헤드를 사용하여 형광 이미지를 얻습니다.
- 405, 488, 561 및 647nm 레이저로 준비를 자극합니다. 20X 0.1 NA 공기 및 40X 1.0 NA 오일 대물렌즈를 사용하여 라인 순차, 레벨링 버튼(2라인 평균)을 클릭하여 단일 평면 512 x 512 픽셀 이미지를 캡처합니다.
- 분석을 위해 섹션당 최소 10개의 시야를 확보하고 각 결과에 대한 데이터를 얻습니다(즉, 각 마우스에 대해 대조군의 경우 10개의 고출력 시야(HFOV), 자극된 샘플의 경우 10개 등).
메모: 전체 필드의 대표 샘플을 얻기 위해, 매트릭스 시스템을 사용할 수 있는데, 여기서 필드는 서로 다른 섹션으로 분할되고, 각각의 다른 샘플에 대해 동일한 매트릭스를 사용하여 시야를 선택합니다(예를 들어, 필드는 9개의 섹션으로 분할될 수 있고, 중앙 및 4개의 모서리로부터, HFOV는 2개입니다).