방법 논문

자가면역 뇌척수염을 유발하기 위한 항원 보조 에멀젼 제조

2025년 7월 8일

이 논문에서

초록

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출처: Bäckström, B. T. 실험적 자가면역 뇌척수염을 유발하기 위한 항원/보조 에멀젼을 준비하기 위한 빠르고 간단하며 표준화된 균질화 방법. J. Vis. 특급. (2022년)

이 비디오는 쥐 모델에서 실험적 자가면역 뇌척수염(EAE)을 유도하기 위해 항원 보조 에멀젼을 생성하는 효율적인 균질화 기술을 보여줍니다. 에멀젼은 물 상태에 자가항원인 미엘린 희소돌기아교세포 당단백질(MOG)을 함유하고 있으며, 불활성화된 병원성 박테리아로 구성된 연속적인 오일 상태로 둘러싸여 있습니다. 에멀젼은 장기적인 면역 반응을 위해 항원의 지속적인 방출을 보장합니다.

프로토콜

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동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

참고: 이 방법의 개략적인 흐름은 그림 1에 설명되어 있습니다.

1. 재료 준비

참고: 모든 시약을 멸균 후드에서 무균으로 준비하고 표시된 온도에서 분취 및 보관하십시오. 시약은 효과를 잃지 않고 최대 2년 동안 보관할 수 있습니다.

  1. 아래와 같이 20mg/mL Mycobacterium tuberculosis를 함유한 CFA를 준비합니다.
    1. 7mL 튜브에 동결 건조된 M. tuberculosis H37RA 100mg(재료 표 참조)과 3.2mm 스틸 비드 5개를 추가합니다(재료 표 참조). 균질기(재료표 참조)에서 튜브를 최고 속도 설정(5,000rpm)에서 60초 동안 흔듭니다.
    2. 불완전한 프로인트 보조제(IFA) 5mL를 튜브에 넣고 최고 속도로 60초 동안 다시 흔듭니다. IFA(현재 CFA로 명명됨)의 균질화된 M. tuberculosis의 슬러리를 비드를 남겨두고 피펫으로 새 튜브에 옮기고 사용할 때까지 4°C에서 보관합니다.
  2. MOG35-55 펩타이드의 동결 건조 분말에 초순수를 첨가하여(재료 표 참조) 10mg/mL의 최종 펩타이드 농도를 얻습니다. 용액을 0.2μm 필터에 통과시켜 살균합니다. 60μL 분취액을 준비하고 사용할 때까지 -20°C에서 보관합니다.
    메모: 이 실험에 사용된 MOG35-55 펩타이드는 ImmunoGrade 순도(~70%)이고, TFA 절단이며, 물에 쉽게 용해되며, C-말단 아미드(-NH2)를 함유하여 생체 내 안정성을 높입니다. 펩타이드 분취액은 두 번 이상 해동 및 재냉동하지 않았으며 사용할 때까지 -20°C에서 보관했습니다.

2. CFA/펩타이드 에멀젼의 제조

  1. 예방 접종에 필요한 에멀젼의 양을 계산합니다. 이 표준 프로토콜에서 각 마우스는 Freund's adjuvant(CFA)에 분산된 50μg의 MOG35-55 펩타이드와 300μg의 M. tuberculosis를 받습니다. 에멀젼 제조에 필요한 각 시약(MOG35-55 펩타이드, PBS, CFA 및 IFA)의 양은 보충 파일 1을 사용하여 계산할 수 있습니다. 에멀젼의 작은 손실을 보상하기 위해 모든 시약의 추가 20%가 계산에 포함됩니다.
    메모: 이 연구에 사용된 상업용 에멀젼 키트(재료 표 참조)는 멸균된 파우치에 튜브, 나사 캡 및 플런저로 구성됩니다. 에멀젼 키트의 각 튜브는 최대 9.6mL를 담을 수 있으므로 40마리의 마우스(또는 동물당 100μL의 에멀젼을 사용하는 경우 80마리의 마우스)를 면역시키기에 충분한 8 x 1mL 주사기를 준비할 수 있습니다.
  2. 나사로 덮인 튜브(상업용 에멀젼 키트에서)와 얼음에 사용할 시약을 놓습니다.
  3. 2.1단계에서 계산된 부피에 에멀젼 성분을 PBS, 펩타이드, CFA의 M. tuberculosis, 마지막으로 IFA의 순서로 추가합니다.
  4. 캡이 있는 튜브를 여러 번 조이고 풀어 단단히 닫습니다. 시약을 미리 혼합하기 위해 손으로 튜브를 5-10초 동안 세게 흔듭니다.
  5. 흔들리는 균질화기에 튜브를 넣고 막대로 고정합니다. 속도를 가장 높은 설정으로 설정하고 시간을 60초로 설정합니다. 달리기가 끝나면 튜브를 얼음 위에 3분 동안 놓습니다. 동일한 설정으로 실행을 한 번 또는 두 번 더 반복합니다.
  6. 300 x g에서 튜브를 1분 동안 원심분리하여 갇힌 공기를 제거하고 에멀젼을 압축합니다.
  7. 튜브에서 캡을 제거하고 플런저를 튜브에 삽입한 다음 에멀젼 상단에 도달할 때까지 천천히 아래로 누릅니다. 튜브 바닥에 있는 스냅 오프 클로저를 비틀어 제거합니다.
  8. 주사기 주사기에서 플런저를 제거합니다(1mL, 재료 표 참조). 주사기 주사기에 바늘 (바람직하게는 25-27 G)을 추가합니다.
  9. 주입 주사기의 뒤쪽 끝을 튜브 하단의 전용 잠금 장치에 장착하고 짧게 비틀어 잠급니다.
  10. 플런저를 부드럽게 밀어 튜브에서 주입 주사기로 에멀젼을 옮깁니다. 에멀젼이 주사기 주사기의 0.15mL 눈금에 도달하면 중지합니다.
  11. 튜브에서 주입 주사기를 분리하고 주사기에 공기가 들어가지 않도록 주의하면서 플런저를 조심스럽게 삽입합니다. 에멀젼이 바늘에서 나올 때까지 플런저를 밉니다.
    메모: 이 시점에서 일부 에멀젼은 품질 관리에 사용할 수 있습니다(3단계 참조).
  12. tube.
    에 있는 나머지 에멀젼에 대해 2.8-2.11단계를 반복합니다. 메모: 값비싼 CFA/항원 에멀젼의 낭비를 최소화하려면 1mL 주사기를 사용해야 합니다. 튜브 하단의 전용 잠금 장치에 맞는 다른 주사기를 사용할 수 있습니다. 그러나 더 많은 양의 에멀젼을 준비해야 할 수도 있습니다. CFA/MOG35-55 펩타이드 에멀젼은 EAE 유도 용량을 잃지 않고 최대 15주 동안 4°C에서 보관할 수 있습니다.

3. 에멀젼의 품질 관리

  1. 낙하 테스트: 20mL의 냉수로 채워진 멸균 50mL 원뿔형 튜브에 에멀젼을 한 방울 떨어뜨립니다. 튜브를 닫고 몇 초 동안 손으로 흔듭니다. 작고 뚜렷한 물방울의 출현은 유중수 에멀젼의 형성을 확인합니다.
  2. 위상차 현미경을 사용하여 에멀젼을 검사합니다.
    1. 유중수 입자의 크기를 분석하려면 에멀젼의 작은 방울(2-3μL)을 현미경 슬라이드에 추가하고 커버 슬립으로 문지른 다음 원을 그리며 세게 밀어 에멀젼을 평평하게 만듭니다.
    2. 400배 배율로 위상차 현미경(재료 표 참조)에서 번진 에멀젼을 검사하고 에멀젼의 단층이 있는 필드에 초점을 맞춥니다. 작고 균일한 회색/흰색 입자가 보이는지 확인합니다(그림 2A).

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결과

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그림 1: 상업용 에멀젼 키트를 사용한 에멀젼 준비 과정의 개략도. 이 그림은 Topping et al의 허가를 받아 재사용되었습니다.

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그림 2: 다양한 방법을 사용하여 생산된 에멀젼의 특성화. (A) 세 가지 다른 준비 방법의 대표 이미지: 표준 균질화 방법, 기존 주사기 방법 및 와류 방법. 소량의 에멀젼을 유리 슬라이드에 놓고 위상차 현미경(400x)으로 관찰했습니다. 스케일 바 = 50μm. >15개의 실험에서 각 방법의 대표적인 제제가 표시됩니다. 평균 D(부피 가중 평균)는 입자 크기 분석기로 진탕 균질화법의 경우 0.7μm, 주사...

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공개 사항

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
선언된 이해 상충이 없습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
1mL 주입 주사기B. 브라운9166017V
1mL 주입 주사기시그마-알드리치Z683531
캡이 있는 7ml 빈 튜브버틴 - 악기P000944LYSK0A.07 mL 튜브
50mL 멸균 원심분리 튜브피셔 사이언티픽1078856150 mL 튜브
분산제, 경광물유시그마-알드리치M8410RT에 보관
에멀젼 키트버틴 - 악기D34200.10 개튜브, 캡 및 플런저 포함
불완전한 프로인트의 보조제시그마-알드리치F5506+4 °C에서 보관
결핵균(Mycobacterium tuberculosis), H37RA피셔 사이언티픽재질 보기 DF3114-33-8+4 °C에서 보관
Minilys-개인 균질화기버틴 - 악기P000673-MLYS0-A진탕 균질기
MOG 35-55 펩타이드이노베이젠해당 사항 없음
몬타니드 ISA 51 VG세픽36362ZFDA 승인 오일 보조제
Pall Acrodisc 주사기 필터 0.2μm피셔 사이언티픽17124381멸균 필터
PBS, Ca2+/Mg2+ 무료써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific14190144PBS (PBS)
위상차 현미경올림푸스BX40-B
스틸 비즈 3.2 mm피셔 사이언티픽NC0445832오토클레이브 및 RT에 보관
)

재인쇄 및 허가

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태그

CFA IFA

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