Gamma Delta 상피내 림프구의 생체 내 시각화

초록

출처: Jia, L., et al. 쥐 소장에서 상피내 림프구의 생체 내 영상.J. Vis. 특급(2019년)

이 비디오는 컨포칼 현미경을 사용하여 형질전환 마우스에서 γδ 상피내 림프구(IEL)를 시각화하는 방법을 보여줍니다. 수술 절차에는 천공 라인을 만들고 장 점막과 융모를 노출시키기 위해 세로로 절개하는 것이 포함됩니다. 형질전환 마우스는 γδ IEL에서만 리포터 단백질을 발현하여 추적을 가능하게 합니다. Intravital 이미징은 장 상피 세포의 기저막을 따라 녹색 형광 표지된 γδ IEL의 동적 움직임을 캡처합니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 마우스 준비

참고: 동물 준비 및 수술을 포함한 다음 절차는 30-40분 정도 소요됩니다. 수술 전에 현미경을 켜고 현미경에 동봉된 인큐베이터를 37°C로 예열하십시오.

1. Bernard Malissen(INSERM, 프랑스 파리)으로부터 얻은 C57BL/6 배경에서 8-10주 된 TcrdEGFP 마우스에 대한 실험을 수행합니다. IACUC가 승인한 절차에 따라 동물의 체중에 따라 케타민(120mg/kg)과 자일라진(10mg/kg)을 i.p. 주사하여 마우스를 마취합니다. 호흡수(분당 55-65회), 발가락 꼬집음 및 안구 반사로 마취 수준을 평가합니다.
2. 외과적 평면 마취에 도달하면 직장 온도계로 모니터링할 수 있는 체온을 유지하기 위해 테이프를 사용하여 마우스의 뒷다리를 가열 패드에 고정합니다. 마취가 약화되는 징후가 있는 경우(예: 호흡수 증가, 눈 깜빡임 및/또는 안구 반사에 대한 눈 근육 경련 반응), 마우스가 완전히 진정될 때까지 한 번에 50μL의 케타민/자일라진을 다시 투여합니다.
3. 50 μL의 Hoechst 33342 (10 mg/mL)를 315 μL의 0.9% 식염수로 희석하여 핵 염료를 제조합니다. 최종 농도는 마우스의 무게(200 μL 대략적인 부피)를 기준으로 37.5 mg/kg입니다. 마우스가 마취되면 투베르큘린 주사기를 사용하여 후안와 정맥동을 통해 Hoechst를 천천히 주입합니다.
   알림: 다음 단계로 진행하기 전에 1-2분 정도 기다렸다가 마우스가 역궤도 주입 후 순환량의 변화에 적응할 수 있도록 합니다.
4. 눈이 건조해지는 것을 방지하기 위해 소량의 윤활제를 눈에 바르십시오.

2. 마우스 수술 : 장 점막을 노출시키는 개복술

1. 하복부의 정중선을 따라 피부와 복막을 통해 2cm 수직 절개를 하여 영상화할 장 부위를 외부화합니다.
2. 각진 집게를 사용하여 복막강에서 맹장을 조심스럽게 빼내고 영상화할 소장 부위를 식별합니다. 이 과정에서 장간막 혈관이 찢어지지 않도록 주의한다. 잠재적인 손상이나 출혈을 최소화하려면 집게로 장을 잡거나 꼬집지 마십시오.
3. 최소한의 배설물 내용물이 포함된 이미징을 위해 소장의 적절한 영역(2-3cm)을 찾습니다. 맹장과 남아있는 소장을 조심스럽게 복막강으로 되돌려 놓고, 관심 부분은 외부화합니다.
   참고: 이 단계에서 맹장에 구멍을 뚫거나 장간막 혈관 구조를 방해하지 마십시오.
4. 혈관 사이의 기저 장간막의 양쪽에 두 쌍의 집게를 놓고 집게의 끝을 부드럽게 문질러 막에 구멍을 만듭니다(그림 1). 이렇게 하면 바늘이 장 아래의 복막강을 닫을 때 장간막을 통과할 수 있습니다.
5. 장의 고리를 외부화한 상태에서 절개 부위를 닫습니다. 각진 집게와 5cm 봉합사에 부착된 구부러진 테이퍼 포인트 바늘을 사용하여 복막의 한쪽을 관통하고 이전 단계에서 만든 구멍을 통과하여 복막 내벽의 다른 쪽을 통해 위로 올라갑니다. 절개 부위의 위쪽에 봉합사 하나를, 절개 부위 아래쪽에 봉합사 하나를 놓습니다.
   알림: 이 단계에서 혈관 구조가 손상되지 않도록 하십시오.
6. 이 과정을 반복하여 절개 부위 중앙, 아래 복막의 이전 봉합사 사이에 봉합사 하나를 배치하여 장 루프 아래의 피부를 닫습니다.
   참고: 이미지화할 영역만 외부화하는 것이 중요합니다. 이렇게 하면 이미징 중 외부 움직임을 줄일 수 있습니다. 장간막 동맥을 묶지 않도록 하십시오.
7. 전기 소작기를 사용하여 장간막 방지 경계를 따라 천공 라인을 만듭니다. 소작 직후 장 표면에 물 몇 방울을 떨어뜨려 열로 인한 조직 손상을 예방한다. Kimwipe로 닦아내어 잔여 수분을 제거합니다.
8. Vannas 가위를 사용하여 소작된 조직의 원위 가장자리에서 작은 수평 슬릿을 자르고 소작된 선의 길이를 따라 외곽 조직 분절의 근위 끝(길이 약 1.5cm)을 향해 절단하여 점막 표면을 노출시킵니다.
   참고: 필요한 경우 집게를 사용하여 노출된 점막 표면에 남아 있는 과도한 배설물을 부드럽게 제거합니다.
9. 조직이 탈수되는 것을 방지하기 위해 촉촉한 Kimwipe로 마우스의 복부를 덮습니다. 뚜껑이 있는 용기에 마우스를 넣어 현미경으로 운반합니다.

3. 스피닝 디스크 컨포칼 현미경에 의한 이미지 획득

1. HBSS의 1μM AlexaFluor 633 중 150μL를 35mm 접시의 유리 덮개 바닥에 피펫팅합니다. 열린 점막 표면이 커버슬립에 직접 닿도록 마우스를 배치합니다.
2. 현미경 헤드를 뒤로 기울이고 이미징 스테이지의 덮개가 덮인 접시에 마우스를 놓습니다.tage 예열된 인큐베이터에서. 또는 체온을 유지하기 위해 가열 담요로 마우스를 덮으십시오.
3. 이미징 소프트웨어를 실행합니다. 각 레이저의 여기 강도 및 노출 시간은 광표백을 방지하고 시점 사이의 간격을 최소화하기 위해 각각 10–15mW 또는 120–150ms를 초과해서는 안 됩니다. 프레임 평균을 "2"로 조정하고 EM 게인 기능을 켜서 배경 소음을 줄입니다. 픽셀 크기의 정확한 측정을 보장하기 위해 63x 대물렌즈 보정을 선택하십시오.
   참고: 위에 설명된 설정은 초기 참조를 제공하기 위한 것이지만 개별 현미경 구성에 따라 달라집니다.
4. 405nm 레이저와 20x 공기 대물렌즈를 사용하여 핵을 시각화하여 눈에 띄는 움직임이나 표류가 없는 융모의 영역을 찾습니다. 호흡, 연동 운동 또는 심장 박동으로 인한 인공물 이동 영역을 피하십시오.
5. XY 스캔을 사용하여 관심 필드의 XY 좌표를 기록하고 글리세롤 이멀젼 63X 대물렌즈로 전환합니다.
6. 최대 1분 동안 405nm 채널에서 라이브 이미지를 획득하여 선택한 필드의 융모가 안정적인지 확인합니다.
7. 405nm 채널에서 라이브 이미지를 획득하는 동안 융모 팁 바로 아래에 있는 직교 평면을 찾도록 초점을 조정합니다. 융모 팁 상피 바로 아래에서 시작하여 1.5μm 단계를 사용하여 약 15–20μm의 핵을 분해하기 어려울 때까지 Z-스택을 획득합니다.
   참고: 위에서 설명한 노출 시간을 사용하여 3개의 채널(405, 488, 640nm)로 이미징할 때 약 20초 간격으로 3개의 채널을 모두 순차적으로 획득할 수 있습니다.
8. 획득 시작 후 3-5분 후에 분석 모드에서 소프트웨어를 열어 이미지 안정성과 γδ IEL 운동성을 확인합니다. 융모의 각 필드에 대해 30–60분 동안 이미지를 계속 획득합니다. 각 마우스에 대해 2-3개의 필드를 기록합니다. 이미징하는 동안 5분마다 마우스를 모니터링합니다.

결과

그림 1: 겸자를 사용하여 장간막에 구멍 만들기.막의 양쪽에 집게를 놓아 봉합사를 위한 구멍을 만듭니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
35mm 디쉬, No. 1.5 커버슬립	매트텍	P35G-1.5-14-C
Alexa Fluor 633 하이드라자이드	인비트로젠	A30634 (영문
BD 프리시전글라이드 피하 주사 바늘 - 27g	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	Tel.: 14-826-48
BD 슬립 팁 멸균 주사기 - 1 ml	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	Tel.: 14-823-434
BD 투베르쿨린 주사기	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	Tel.: 14-829-9
가위 해부	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	08-940
전기 소작	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	50822501
밀폐된 배양실	오콜랩		현미경
눈 바늘, 크기 #3; 1/2 원, 테이퍼 포인트, 12mm 코드 길이	로보즈	RS-7983-3
Hank's Balanced Salt 솔루션	시그마-알드리치	55037씨
회스트: 33342	인비트로젠	H3570
반전된 DMi8	라이카		현미경
케타민	퍼트니		마취
킴와이프	폭스바겐	21905-026
McPherson-Vannas 가위 3"(7.5cm) 길이 5X0.15mm 스트레이트 샤프	로보즈	RS-5600
비흡수성 수술용 봉합사, 실크 스풀, 블랙 브레이디드	피셔 사이언티픽	NC0798934
Nugent 집게 4.25"(11cm) 긴 각진 부드러운 1.2mm 팁	로보즈	RS-5228
Puralube 수의사 연고	데크라		윤활 눈 연고
63x 1.3 NA HC PLAN APO 글리세롤 이멀젼 대물렌즈, iXon Life 888 EMCCD 카메라, 405nm 다이오드 레이저, 488nm DPSS 레이저, 640nm 다이오드 레이저가 있는 회전 디스크 Yokogawa CSU-W1	안도르		컨포칼 시스템
자일라진	아콘		마취

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