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1. LMP 제작 및 특성화
참고: 오염을 방지하기 위해 이 실험에 사용된 모든 재료가 멸균 또는 오토클레이브되었는지 확인하십시오. 달리 명시되지 않는 한 멸균 상태에서 생물 안전 캐비닛의 RT에서 모든 단계를 수행하십시오.
- 의원의 자극과 수집
- 1,000만 CEM T 세포의 분취액을 37°C 수조에서 해동합니다. X-VIVO와 같은 10ml의 예열 혈청이 없는 조혈 배지에 15ml 멸균 튜브와 원심분리기를 넣고 200g x 5분으로 희석합니다. 상층액을 흡인하고 5ml의 예열된 배지에 세포를 재현탁합니다.
- X-VIVO와 같은 15ml의 예열 조혈 배지가 있는 T75 조직 배양 플라스크(현탁 세포용)로 세포를 옮기고 37°C의 가습 인큐베이터에서 5%CO2로 4일 동안 배양합니다.
- 4일 후, 모든 배양 배지와 세포를 100ml의 신선한 배지가 들어 있는 T175 조직 배양 플라스크에 옮깁니다. 200만 cells/ml의 밀도로 성장할 때까지 동일한 조건에서 약 72시간 동안 세포를 계속 배양합니다.
- 각각 150ml의 신선한 배지를 포함하는 4개의 T175 플라스크 간에 세포를 고르게 분할하고 세포가 200만/ml의 밀도로 성장할 때까지(약 48시간 배양) 세포 배양을 계속합니다.
- 200 x g에서 5분 동안 원심분리하여 각 플라스크에서 세포를 수집하고 300 x 106 세포를 150ml의 신선한 배지가 들어 있는 새로운 T175 플라스크에 재현탁하여 200만/ml 세포 밀도를 유지합니다.
- actinomycin D(2mg/ml에서 DMSO에 용해됨)를 최종 농도 0.5μg/ml로 배지에 추가하고 24시간 동안 배양합니다.
- 모든 배양 배지를 50ml 원뿔형 튜브로 옮기고 750 x g에서 5분 동안 세포를 스핀다운합니다.상층액을 50ml 원뿔형 튜브로 옮기고 1,500 x g에서 15분 동안 원심분리하여 큰 세포 조각을 제거합니다.
- 상층액을 250ml 병에 옮기고 12,000 x g에서 50분 동안 초원심분리기합니다. 상등액을 버리고 펠릿을 수집합니다.
- 50ml 튜브에 40ml 멸균 PBS가 포함된 LMP가 농축된 펠릿을 12,000 x g에서 50분 동안 원심분리하여 이 단계를 두 번 반복합니다.
- 마지막 세척 상등액을 수집하여 차량 제어로 사용됩니다. LMP 펠릿을 PBS 1ml에 현탁시키고 1.5ml 멸균 마이크로튜브로 옮깁니다. 분리 LMP를 -80°C에서 부분 표본으로 추출하여 보관합니다(여러 번의 자유 해동 주기를 방지하기 위해).