In vitro에서 Apoptotic T 림프구에서 유래한 미세입자의 분리

초록

출처: Yang, C. et al., 림프구 미립자의 생성 및 기도 상피 세포에 대한 Proapoptotic 효과 검출. J. Vis. 특급. (2015년)

이 비디오는 악티노마이신-D로 치료한 후 T 림프구에서 T 림프구 유래 미립자(LMP)의 생성 및 분리를 보여줍니다.

프로토콜

1. LMP 제작 및 특성화

참고: 오염을 방지하기 위해 이 실험에 사용된 모든 재료가 멸균 또는 오토클레이브되었는지 확인하십시오. 달리 명시되지 않는 한 멸균 상태에서 생물 안전 캐비닛의 RT에서 모든 단계를 수행하십시오.

1. 의원의 자극과 수집
   1. 1,000만 CEM T 세포의 분취액을 37°C 수조에서 해동합니다. X-VIVO와 같은 10ml의 예열 혈청이 없는 조혈 배지에 15ml 멸균 튜브와 원심분리기를 넣고 200g x 5분으로 희석합니다. 상층액을 흡인하고 5ml의 예열된 배지에 세포를 재현탁합니다.
   2. X-VIVO와 같은 15ml의 예열 조혈 배지가 있는 T75 조직 배양 플라스크(현탁 세포용)로 세포를 옮기고 37°C의 가습 인큐베이터에서 5%_CO2로 4일 동안 배양합니다.
   3. 4일 후, 모든 배양 배지와 세포를 100ml의 신선한 배지가 들어 있는 T175 조직 배양 플라스크에 옮깁니다. 200만 cells/ml의 밀도로 성장할 때까지 동일한 조건에서 약 72시간 동안 세포를 계속 배양합니다.
   4. 각각 150ml의 신선한 배지를 포함하는 4개의 T175 플라스크 간에 세포를 고르게 분할하고 세포가 200만/ml의 밀도로 성장할 때까지(약 48시간 배양) 세포 배양을 계속합니다.
   5. 200 x g에서 5분 동안 원심분리하여 각 플라스크에서 세포를 수집하고 300 x 10⁶ 세포를 150ml의 신선한 배지가 들어 있는 새로운 T175 플라스크에 재현탁하여 200만/ml 세포 밀도를 유지합니다.
   6. actinomycin D(2mg/ml에서 DMSO에 용해됨)를 최종 농도 0.5μg/ml로 배지에 추가하고 24시간 동안 배양합니다.
   7. 모든 배양 배지를 50ml 원뿔형 튜브로 옮기고 750 x g에서 5분 동안 세포를 스핀다운합니다.상층액을 50ml 원뿔형 튜브로 옮기고 1,500 x g에서 15분 동안 원심분리하여 큰 세포 조각을 제거합니다.
   8. 상층액을 250ml 병에 옮기고 12,000 x g에서 50분 동안 초원심분리기합니다. 상등액을 버리고 펠릿을 수집합니다.
   9. 50ml 튜브에 40ml 멸균 PBS가 포함된 LMP가 농축된 펠릿을 12,000 x g에서 50분 동안 원심분리하여 이 단계를 두 번 반복합니다.
   10. 마지막 세척 상등액을 수집하여 차량 제어로 사용됩니다. LMP 펠릿을 PBS 1ml에 현탁시키고 1.5ml 멸균 마이크로튜브로 옮깁니다. 분리 LMP를 -80°C에서 부분 표본으로 추출하여 보관합니다(여러 번의 자유 해동 주기를 방지하기 위해).

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
CEM T 세포	증권 시세	CCL-119
X-VIVO 15 미디엄	캠브렉스, 워커스빌	04-744큐
플라스크 T75	사르슈테트	83.1813.502
플라스크 T175	사르슈테트	83.1812.502
악티노마이신 D	시그마 케미컬	A9415-2MG
PBS (PBS)	생명공학	14190-144
0.22μm 필터	사르슈테트	83.1826.001
세포 배양기	만델	헤라셀 150
저속 원심분리기	국제전기기술위원회	센트라8R
고속 원심분리기	베크만	아반티 J8
250ml 병용 고속 로터	베크만	JLA16.250
50ml 튜브용 고속 로터	베크만	JA30.50

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