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동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.
1. 준비된 나노 입자 인공 항원 제시 세포로 항원 특이적 CD8+ T 세포를 풍부하게 합니다.
- CD8+ T 세포를 분리합니다.
- 이소플루란에 노출된 후 자궁경부 탈구를 일으켜 동물을 안락사시킨다.
- 야생형 C57BL/6j 마우스에서 비장과 림프절을 제거하고 PBS 용액에 넣습니다. 장기를 침식하고 PBS를 자주 세척하는 멸균 70μm 세포 여과기를 통해 세포를 용출합니다.
- CD8+ T cell이 아닌 세포를 제거하려면 비접촉 CD8+ T cell isolation kit를 사용하고 제조업체의 지침을 따르십시오.
참고: 각 항원 상태에는 최소 3 x 106 CD8+ T 세포가 필요합니다.
- 나노 입자 aAPC를 첨가하여 CD8+ T 세포에 결합합니다.
- 분리 후 0.5% 소 혈청 알부민(BSA) 및 2mM EDTA와 함께 PBS에서 100μL 부피로 농축합니다.
- 106 CD8+ T 세포당 1011 aAPC 결합, 펩타이드 로딩 MHC-Ig의 비율을 기반으로 계산하여 추가할 aAPC의 수를 결정합니다.
- 멸균 5mL 폴리스티렌 원형 바닥 튜브에서 연속 혼합으로 4°C에서 1시간 동안 aAPC 입자 및 CD8+ T 세포를 배양합니다.
- CD8+ T 세포를 용출 및 배양하기 위해 보충된 배지와 T 세포 성장 인자(TCGF)를 준비합니다.
- 보충된 배지의 경우, 비필수 아미노산 1개, 피루브산 나트륨 1mM, 비타민 용액 0.4개, 2-메르캅토에탄올 92μM, 시프로플록사신 10μM 및 소 태아 혈청(FBS) 10%로 완전한 RPMI 1640 배지(글루타민 포함)를 보충합니다.
- TCGF를 만들려면 확립된 프로토콜을 따르십시오.
메모: TCGF는 인간 면역 사이토카인의 사내 칵테일로, T 세포가 성장하는 데 필요한 추가 자극 신호를 제공하는 데 필수적입니다. TCGF는 IL-2, IL-7 또는 IL-15와 같은 알려진 T 세포 자극 사이토카인으로 교환할 수 있습니다. 그러나 각각은 그에 따라 T 세포 반응을 분극화할 수 있습니다.
- aAPC 및 CD8+ T 세포 혼합물을 세척하고 농축합니다.
- 첫 번째는 0.5% BSA 및 2mM EDTA가 포함된 PBS 버퍼를 사용하여, 두 번째는 보충 매체를 사용하여, 세 번째는 1% TCGF가 포함된 보충 매체를 사용하여 자성 입자 aAPC를 세척합니다.
- 1% TCGF가 함유된 500μL의 보충 배지에서 aAPC 및 농축 CD8+ T 세포를 용리합니다.
- 2.5 x 105 CD8+ T cells/mL의 농도에서 1% TCGF가 포함된 보충 배지의 160μL에 있는 96 U-바닥 플레이트의 혈구계와 플레이트를 사용하여 세포를 계수합니다.
- 표면에 펩타이드가 로드된 MHC-Ig만 있는 aAPC를 사용하여 분리하는 경우(동시 자극 신호 없음) 4.5단계를 완료합니다. 표면에 펩타이드가 로드된 MHC-Ig와 동시 자극 신호가 모두 있는 aAPC를 사용하여 분리하는 경우 5단계로 진행합니다.
- 표면에 동시 자극 신호로 코팅된 자기 입자를 농축된 분획에 추가하고 자기장을 추가하여 T 세포 표면의 자극 신호를 공동 클러스터링합니다.
- 농축된 분획에 입자에 펩타이드가 로드된 MHC-Ig의 수에 등몰(또는 응용 분야에 따라 더 커짐)
을 추가합니다.
- 공동 자극 자성 입자가 4°C에서 1시간 동안 농축된 CD8+ T 세포에 결합할 수 있도록 합니다.
- 길이가 1.9cm(0.75인치)인 두 개의 네오디뮴 N52 디스크 자석 사이에 배양 플레이트를 배치하여 자기장을 추가합니다.
메모: N52 디스크 자석은 매우 강한 자기장을 가지고 있습니다. 배양 플레이트에 올려 놓을 때 서로 제거하기 어렵기 때문에 자석 사이에 스페이서와 함께 보관할 때 둘 다 주의해야 합니다. 자석이 인큐베이터의 금속 부품에 달라붙는 것을 최소화하려면 바닥과 상단 모두에 있는 50mL 원뿔형 튜브 스티로폼 용기에 자석을 넣으십시오.
2. 준비된 나노 입자 인공 항원 제시 세포로 항원 특이적 CD8+ T 세포 확장 및 검출
- aAPC 및 CD8+ T 세포가 있는 96 U-바닥 웰 플레이트를 가습된 5% CO2, 37 °C 인큐베이터에 3일 동안 추가합니다. 3일차에 2% TCGF가 함유된 보충된 배지 웰당 80μL를 세포에 공급하고 7일차까지 인큐베이터에 다시 넣습니다.
- 7일째에 자극된 세포를 5mL의 둥근 바닥 튜브에 넣어 계수합니다.
- 모든 용액이 수확되면 수확된 세포를 스핀다운하여 0.05% 아지드화나트륨 및 2% FBS와 함께 0.5mL의 PBS에 재현탁합니다. trypan blue로 염색하고 혈구계로 세어 생존 가능한 세포를 계산합니다.
- 항원 특이적 염색을 위해 50,000-500,000 계수 세포를 두 개의 새로운 5 mL 둥근 바닥 튜브로 제거합니다. 하나의 튜브는 동족 펩타이드-MHC 염색에 사용되고 다른 튜브는 배경 염색을 결정하기 위해 비동족 염색에 사용됩니다.
- 0.05% 아지드나트륨이 포함된 PBS 100μL와 알로피코시아닌(APC) 접합 쥐 안티 마우스 CD8a가 있는 2% FBS가 포함된 PBS의 각 동족 및 비동족 튜브에 1μg의 비오틴화된 MHC-Ig를 4°C에서 1시간 동안 클론 53-6.7(1:100의 희석 비율)
을 추가합니다.
- 2차 스트렙타비딘과 살아있는 죽은 얼룩을 첨가합니다. 원심분리를 통해 PBS로 과량의 비오틴화된 MHC-Ig를 씻어냅니다. 그런 다음 4°C에서 15분 동안 1:350 비율의 phycoerythrin(PE) 표지 streptavidin과 1:1000 비율의 살아있는/죽은 고정 가능한 녹색 사구 염색으로 모든 샘플을 염색합니다.
- 유세포 분석기에서 모든 샘플을 판독하여 항원 특이적 세포의 특이성과 수를 측정합니다.
- 원심분리를 통해 과도한 2차 및 살아있는/죽은 염색을 세척하고 0.05% 아지드화나트륨 및 2% FBS가 포함된 150μL의 PBS 완충액으로 재현탁하여 유세포분석기에서 판독합니다.
- 데이터 분석 소프트웨어로 항원 특이적 세포의 수와 비율을 측정합니다.
- 항원 특이적 세포의 비율을 측정하려면 live+, lymphocyte+(side scatter에 의한 전방 산란), CD8+ 및 Dimer+의 순서로 다음 게이트를 사용하십시오. 비동족 염색과 동족 염색을 비교하여 Dimer+ 게이트를 결정합니다.
- 비동족 MHC-Ig 염색에서 동족 MHC-Ig 염색의 Dimer+ 비율을 빼서 샘플 내 항원 특이적 세포의 백분율을 계산합니다.
- 이 항원 특이적 세포의 백분율을 사용하여 계수된 세포 수를 곱하여 농축 및 확장으로 인한 항원 특이적 세포의 수를 산출합니다.
메모: 이 패널에 사용된 형광단과 스펙트럼 중복이 있기 때문에 유세포 분석기에서 보상을 설정해야 합니다.