쥐 복막강에서 일차 비만 세포를 분리하는 기술

초록

출처: Tsvilovskyy, V., et al. Ca²⁺ 이미징 및 탈과립 분석을 통한 복막 유래 비만 세포의 분리 및 기능적 특성화. J. Vis. 특급 (2018).

이 비디오는 성체 마우스의 복막강에서 성숙한 결합 조직형 비만 세포를 분리하기 위한 복막 세척 방법을 보여줍니다. 복막강에서 1차 면역 세포의 혼합물을 분리한 후, 적절한 배양 조건에서 비만 세포의 선택적 증식을 수행합니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 복강내 세척에 의한 PMC 분리

1. 세포를 분리하기 전에 표 1에 나열된 재료를 준비합니다.
2. PMC 분리를 위해 8주에서 14주 된 수컷 마우스를 사용하십시오. CO₂ 흡입으로 마우스를 안락사시키고 반사 상실로 인한 죽음을 확인합니다. 마우스에 70% 에탄올을 뿌리고 핀(등쪽이 아래로)을 사용하여 폼 블록에 고정합니다. 뭉툭한 가장자리 가위를 사용하여 마우스의 복부 피부를 제거합니다. 복막강 손상을 피하십시오.
   메모: 우리는 일반적으로 C57BL/6N 균주 유전적 배경을 가진 마우스에 대해 이 프로토콜을 사용합니다.
3. 27G 바늘이 장착된 10mL 주사기를 사용하여 얼음처럼 차가운 RPMI 배지 7mL와 공기 5ml를 복강에 주입합니다. 바늘을 복막에 조심스럽게 밀어 넣고 장기에 구멍을 뚫지 마십시오. 장기 천공의 위험을 줄이기 위해 부고환 지방 부위의 반점을 사용하십시오.
4. 주사 후 마우스를 1분 동안 흔들어 복막 세포를 RPMI 배지로 분리합니다. 내부 장기가 손상되고 복막강이 혈액으로 오염되는 것을 방지하기 위해 마우스를 너무 세게 흔들지 마십시오.
5. 10mL 주사기에 새로운 20G 캐뉼라를 장착하여 재사용합니다. 폼 블록을 기울이고 벤치를 부드럽게 두드려 내부 장기를 한쪽으로 이동하여 다른 쪽에서 중간 흡인을 더 쉽게 할 수 있습니다. 20G 바늘을 삽입하고 베벨을 높인 다음 복부에서 나오는 액체를 부드럽고 천천히(~0.5mL/s) 흡입하여 내부 장기가 막히지 않도록 합니다. 가능한 한 많은 액체(일반적으로 5-6mL)를 수집합니다.
6. 주사기에서 바늘을 제거하고 수집된 세포 현탁액을 얼음 위의 수집 튜브로 옮깁니다. 샘플 폐기amp혈액 오염이 보이는 경우 튜브.
7. 세포 현탁액이 있는 튜브를 ~300 x g에서 5분 동안 원심분리합니다. 멸균 후드 아래에서 상층액을 흡입하십시오. 각 마우스에 대해 4mL의 차가운(4–10°C) PMC 배지에 샘플 펠릿을 결합하고 세포 현탁액을 25cm² 배양 플라스크로 옮깁니다. 성장 인자 IL-3 및 SCF를 각각 10ng/mL 및 30ng/mL의 최종 농도에 추가합니다. 세포가 들어있는 플라스크를 인큐베이터 (37 ° C 및 5 % CO₂)에 놓고 다음 절차까지 ~ 48 시간 동안 배양합니다.

표 1: 1단계 재료.

개 개 개 개 개 분 세 세 세 분 분 세 의 분 세 분 분 분

1	얼음
2	10mL 주사기
3	바늘 27g
4	바늘 20g
5	스티로폼 블록 및 핀
6	수집 튜브(50mL 플라스틱 원심분리기 튜브)
7	70% 에탄올
8	RPMI Medium (사전 냉각 후 얼음에 보관)
9	PMC 배지: RPMI 배지 + 20% FCS(송아지 태아 혈청) + 1% 페니실린 스트렙토마이신 용액(Pen-Strep)
10	Dulbecco의 인산염 완충 식염수 - DPBS (Ca2+ 및 Mg2+ 제외)
11	문화 플라스크 (25cm)
12	성장 인자 원액(IL-3: 1μg/μL; SCF: 2.5 μg/mL)
13	혈청학적 피펫(10mL)
14	피펫 팁 멸균 (20–200 μL)
15	혈구계
16	벤치 원심분리기
17	가위와 집게
18	마우스용 CO2 챔버
19	개방형 멸균 후드
20	폐쇄형 멸균 후드
21	세포 배양기(37°C 및 5% CO2)
22	이송 피펫(20–200 μL)

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
RPMI 배지	써모 사이언티픽(Thermo Scientific	21875034
디피에스	시그마-알드리치	14190144
증권 시세	써모 사이언티픽(Thermo Scientific	R92157
일리노이 -3	R&D 시스템	403 밀리리터
증권 시세	써모 사이언티픽(Thermo Scientific	PMC2115
펜스트렙	써모 사이언티픽(Thermo Scientific	15140122
문화 플라스크 (25cm)	Greiner 바이오 원	69160
15 mL 플라스틱 원심분리기 튜브	사르슈테트	6,25,54,502
벤치 원심분리기	헤레우스	메가푸지 1.0R

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