Spiral Microfluidics Channel을 사용한 기관 분비에서 무표지 호중구 분리

초록

출처: Ryu, H., et al., Label-free Neutrophil Enrichment from Patient-derived Airway Secretion Using Closed-loop Inertial Microfluidics(폐쇄 루프 관성 미세유체역학을 사용한 환자 유래 기도 분비에서 무표지 호중구 농축).J. Vis. 특급(2018).

이 비디오는 나선형 채널이 있는 미세유체 장치를 사용하여 기관 분비물에서 호중구를 분리하는 방법을 보여줍니다. 이 장치는 다양한 두께와 사다리꼴 모양의 채널을 활용하여 세포 크기에 따라 효율적인 분리를 달성합니다. 힘 간의 상호 작용으로 인해 큰 호중구가 내벽 근처에 축적되는 반면 적혈구와 뮤신 응집체는 외벽 근처에 남아 효과적인 호중구 분리를 보장합니다.

프로토콜

인간 참가자와 관련된 모든 절차는 인간 복지를 위한 제도적, 국가적, 국제적 지침에 따라 수행되었으며 지역 기관 검토 위원회의 검토를 거쳤습니다.

1. 장치 제작 및 소프트 리소그래

피

참고: 폴리디메틸실록산(PDMS) 마이크로채널을 만들기 위해 표준 소프트 리소그래피 기술이 사용되었습니다.

1. PDMS 전구체를 염기제와 경화제의 10:1 비율로 혼합합니다.
2. PDMS 전구체 혼합물 30g을 미세 가공 알루미늄 몰드(치수는 그림 1 참조)에 붓고 PDMS 전구체 혼합물 20g을 100mm 페트리 접시에 붓습니다.
   메모: 페트리 접시는 지지층을 위한 PDMS(~3mm)의 후막을 만드는 데 사용됩니다. PDMS의 지지층은 미세유체역학 전반에 걸쳐 균일한 물리적 표면 특성을 제공합니다. 또는 유리 슬라이드의 얇은 PDMS 필름을 사용할 수 있습니다. 특정 채널 치수의 마스터 몰드는 알루미늄 시트의 마이크로 밀링으로 설계 및 제작되었습니다. 이 연구에 사용된 나선형 채널은 1개의 입구와 2개의 출구가 있는 8루프 나선형 마이크로 채널이었으며 효율적인 크기 기반 분리를 위해 반경이 8mm에서 24mm로 증가했습니다.
3. 곰팡이와 페트리 접시를 진공 데시케이터에 넣어 표면에 기포가 보이지 않을 때까지(일반적으로 5 - 10분) 탈기합니다. 데시케이터에는 집 진공 청소기를 사용하십시오.
4. 진공 청소기를 풀고 금형과 페트리 접시를 90°C 오븐에 1시간 동안 넣습니다.
   메모: 오븐 대신 핫플레이트나 기타 가열 도구를 사용할 수 있습니다.
5. 오븐에서 곰팡이와 페트리 접시를 제거하고 실온에서 10분 동안 식힙니다.
6. 윤곽선을 조심스럽게 잘라내고 2mm 펀처를 사용하여 장치의 유체 접근 구멍을 펀칭합니다.
   메모: 펀치의 크기는 튜브 또는 유체 가이드의 크기에 따라 달라질 수 있습니다.
7. 장치의 채널 쪽에 테이프를 붙이고 PDMS의 두꺼운 필름을 붙이고 집게로 조심스럽게 벗겨내어 먼지를 제거합니다.
8. 장치의 채널 측과 일반 PDMS를 모두 공기 플라즈마로 처리하고 일반 PDMS의 준비된 지지층과 접착합니다(그림 1A).
9. 칩을 50mm x 70mm 유리 슬라이드에 놓고 70°C 오븐에 최소 30분 동안 넣어 접착 강도를 높입니다.

2. 기계 환기 환자의 기관 분비 채취

참고: 기관 분비물은 표준 성인 인공호흡 환자를 수용하기 위해 기존 방법에서 수정된 프로토콜을 사용하여 정상적인 일상 기도 관리 중에 기계적으로 인공호흡을 하는 환자로부터 얻을 수 있습니다. 샘플은 비식별화되어 즉시 처리를 위해 보내졌습니다.

1. 기관 흡인이 표시되면 카테터를 사용하여 기도 분비물을 추출합니다.
2. 카테터를 기관내관의 중간쯤 조심스럽게 밀어 넣고 미리 채워진 10mL 주사기에서 0.9% 멸균 생리 식염수 5mL를 주입합니다.
3. 카테터가 완전히 진행되거나 내성이 충족되면 분비물을 흡인하고 멸균 가래 채취 용기에 모읍니다.
4. 멸균 가래 용기에 기관 분비물 10mL를 모아 얼음 위에 놓습니다. 처리를 위해 즉시 샘플을 보내십시오.

3. 기관 분비 시료 준비

참고: 모든 실험은 적절한 개인 보호 장비와 함께 생물 안전 캐비닛 아래에서 수행해야 합니다.

1. 플라스틱 10mL 주사기(10배 희석용)를 사용하여 9mL의 인산염 완충 식염수(PBS)에 1mL의 기도 분비물 샘플을 분산시킵니다. 뭉툭한 피펫을 사용하여 점액 샘플을 균질화합니다.
2. 40μm 나일론 세포 스트레이너로 희석액을 걸러내어 미세유체 접근 구멍 또는 채널을 막을 수 있는 큰 덩어리나 혈전을 제거합니다. 처리 후 샘플을 얼음 위에 놓습니다.
3. 100배 부피의 PBS 버퍼를 사용하여 각 샘플의 희석액을 분산시켜 1,000배 희석된 현탁액을 만듭니다. 전체 해리 작업 동안 샘플을 얼음 위에 놓습니다.

4. 실험적 설정

참고: 모든 실험은 적절한 개인 보호 장비와 함께 생물 안전 캐비닛 아래에서 수행해야 합니다.

1. PDMS 칩을 유체 가이드와 조립하여 4개의 나선형 마이크로채널 각각에 균일한 흐름을 적용합니다(그림 1B).
   메모: 4개의 채널을 사용하여 병렬화를 통한 처리량을 늘리고 결과 현탁액의 부피 및 세포 밀도를 최적화했습니다. 유체 가이드는 투명 레진이 있는 광조형형 3D 프린터로 설계 및 제작되었습니다. 유체 가이드의 입구와 출구 포트는 암 루어 커넥터를 사용하여 작동 중 연결이 용이하고 안정적인 밀봉이 가능합니다.
2. 1/16인치 수 Luer 커넥터를 유체 가이드의 입구, 내벽(IW) 배출구 및 외벽(OW) 출구 포트에 연결하고 실리콘 튜브를 s에 연결합니다.amp르 서스펜션.
3. 흡입구와 배출구의 양쪽 끝에 뭉툭한 팁을 삽입하여 샘플 저장소의 바닥에 도달합니다.
4. 연동 펌프를 주입구 튜브에 연결합니다.
5. 입구 튜브와 IW 출구 튜브의 끝을 s에 놓습니다.ample 저장소를 만들고 OW 출구 튜브의 끝을 폐기물 저장소에 놓습니다(그림 1C, D).
6. 칼슘과 마그네슘이 없는 여과된 PBS의 50mL 튜브를 시료 저장소에 넣습니다.
7. 낮은 유속(~1mL/분)에서 펌핑을 시작하여 장치를 프라이밍합니다.
   메모: 채널에서 기포가 포착되면 핀셋으로 채널 상단을 밀어 기포를 불안정하게 만들고 제거합니다. 장치에 완충 용액이 완전히 채워지면 PBS 튜브를 변경하여 기도 분비물 샘플 튜브를 준비합니다.
8. 샘플이 샘플 저장소에 놓일 때 연동 펌프를 켜고 유속을 4mL/분으로 설정합니다(그림 1C, D).
9. s가 때amp부피가 지정된 부피(~1mL)에 도달하면 작동을 중지하고 실리콘 튜브를 분리하십시오.
   메모: 제안된 방법은 많은 양의 희석제(>50mL)를 마이크로 원심분리 튜브 부피(~1mL)로 줄이는 데 더 효율적입니다(그림 2).

결과

그림 1: 나선형 미세유체 장치 및 실험 설정. (A) 나선형 미세유체역학 및 (B) 유체 어댑터와 조립된 장치의 이미지를 촬영합니다. (C) 나선형 관성 미세유체역학을 사용한 폐쇄 루프 분리의 개략도. 입자/세포 농축 스트림(IW 배출구)을 원래 샘플 저장소로 다시 재순환시킴으로써, 면역 관련 세포는 소량으로 농축되는 동시에 뮤신 응집체와 미량 적혈구를 포함하는 배경 유체는 OW 배출구에 연결된 폐기물 튜브를 통해 지속적으로 제거되었습니다. (D) 실험 설정 및 10μm 입자의 형광 이미지, 궤적(녹색) 및 나선형 채널의 출구(오른쪽 상단).

그림 2: closed-loop inertial ...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
PDMS 프리커서	다우 코닝	184 SIL ELAST 키트 3.9KG	10:1 염기제와 경화제의 비율
VWR 중력 대류 오븐	폭스바겐	제414005-128	PDMS 전구체는 90°C에서 경화됩니다.
100mm 페트리 접시	폭스바겐	89000-324	PDMS 지지층 제작
해리스 유니 코어 펀처	시그마 알드리치	WHAWB100076	2mm 직경 또는 튜브 크기에 따라 다른
공기 플라즈마 기계	펨토 사이언스	귀여운	PDMS 장치를 위한 지상 플라스마 처리는 밑바닥 기초에 처리합니다.
2" x 3" 유리 슬라이드	테드 펠라, INC.	2195	PDMS 장치를 지원하려면
Masterflex 스풀 백금 경화 실리콘 튜브, L/S 14	콜-파머	EW-96410-14	미세유체역학(microfluidics) 및 연동 펌프(peristlatic pump)를 위한 튜빙
1/16인치 루어 커넥터, 수	하버드 기구	PC2 72-1443	유체 가이드용 커넥터
50mL 팔콘 튜브	코 닝	21008-940	샘플 채취 및 준비
인산염 완충 식염수, 칼슘 및 마그네슘 없는 1X	코 닝	45000-446	시료를 희석하기 위한 완충 용액
핼야드 폐쇄 흡입 카테터, 팔꿈치, 14F / 채널 4.67mm	핼야드 헬스	22113	기관 분리 흡입 카테터
0.9% 멸균 생리식염수, 10mL 프리필드 시린지	BD 포지플러시	NHRIC : 8290-306547	환자의 기관 분리 채취를 위해
SecurTainer™ III 검체 용기, 20mL	스임포트	1176R36	무균 가래(기도 분비물) 채취 용기
Luer-Lok 팁이 있는 주사기, 10mL	BD (영어)	BD309604	점액 샘플을 피펫으로 균질화하고 샘플 튜브의 바닥에 도달합니다.
BD Blunt Fill Needle, BD Luer-Lok 팁 포함	BD (영어)		점액 샘플을 피펫으로 균질화하고 샘플 튜브의 바닥에 도달합니다.
40μm 나일론 셀 스트레이너	송골매	21008-949	microfluidics 접근 구멍 또는 채널을 막을 수 있는 큰 덩어리 또는 혈전을 제거하기 위하여.
연동 펌프(Masterflex L/S 디지털 드라이브)	콜-파머	HV-07522-30	미세유체역학의 작동

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