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동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.
1. 시약 및 재료 준비
- 2% 소 태아 혈청(FBS)과 1mM 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)을 함유한 인산염 완충 식염수(PBS) 500mL를 준비합니다.
메모: 최적의 결과를 위해 전체 절차 동안 버퍼를 얼음 위에 두십시오.
- RPMI 1640, 10% FBS 및 1% 페니실린-스트렙토마이신을 함유한 완전한 RPMI 배지 50mL를 준비합니다. THGM 세포 분화를 위해 50μM β-메르캅토에탄올을 함유한 완전한 RPMI 배지를 사용합니다. β-메르캅토에탄올을 흄 후드에 추가합니다.
- PBS에서 항-CD3e 농축 스톡을 3μg/mL로 희석하여 7.5mL의 항-CD3e 항체 혼합물을 준비합니다. 각 웰에 150μL의 항체 혼합물을 첨가하여 48웰 플레이트를 코팅하고 37°C에서 최소 1시간 동안 또는 4°C에서 하룻밤 동안 플레이트를 배양합니다.
- 가위와 집게를 소독하고 해부 사이에 70% 에탄올에 보관하십시오.
2. 쥐 비장 세포의 준비
- 기관에서 승인한 CO2 질식 또는 자궁경부 탈구를 사용하여 마우스(6-8주령)를 안락사시킵니다. 마우스에 70% 에탄올을 뿌리고 뒷면의 폴리스티렌 블록에 장착합니다. 마우스를 생물 안전 캐비닛으로 옮기고 다음 단계를 진행하십시오.
- 집게로 피부를 잡고 가위를 사용하여 왼쪽 흉곽 아래 피부를 약 4cm 정도 자릅니다. 복막낭을 열어 비장을 드러내고 멸균 집게를 사용하여 비장을 추출합니다.
- 50mL 튜브에 70μm 세포 여과기를 놓고 2mL의 완충액으로 미리 적십니다. 세포 여과기(세포 여과기 1개에 비장 2-3개)에 비장을 놓고 5mL 주사기 플런저 끝을 사용하여 비장을 침식합니다.
- 모든 세포가 튜브로 플러시될 때까지 1-2mL의 세포 분리 버퍼로 스트레이너와 튜브를 여러 번 헹굽니다. 세포 여과기를 버리고 350 x g에서 4°C에서 5분 동안 세포를 원심분리합니다. 상층액을 버립니다.
- 세포 펠렛을 5mL의 냉(4°C) 암모늄-염화물-칼륨(ACK) 용해 완충액(150mM NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0.1 mM Na2EDTA, pH 7.2–7.4)으로 재현탁하고 2분 동안 부드럽게 혼합합니다. 10mL의 완전한 RPMI 배지를 추가하여 ACK 완충액을 중화하고 즉시 350 x g에서 4°C에서 5분 동안 세포를 원심분리합니다. 원심분리 후 상등액을 폐기합니다.
3. 마그네틱 CD4 마이크로비즈 및 세포 분리 컬럼을 사용한 CD4+ T 세포 분리
- 세포 펠렛을 5mL의 세포 분리 완충액에 재현탁합니다. 사전 분리 필터(30μm)를 사용하여 세포 현탁액을 새 15mL 튜브에 여과하여 이물질을 제거합니다.
- 세포 현탁액 10μL를 취하고 완충액 90μL를 추가하여 10배 희석합니다. 10μL의 희석된 세포 현탁액을 10μL의 트리판 블루와 혼합하여 세포 계수를 수행합니다. 혈구계에서 세포를 계수하여 생존 가능한 세포의 수율을 결정합니다.
- 350 x g에서 4°C에서 5분 동안 세포를 원심분리하고 상층액을 버립니다.
- 107 cells당 90 μL의 buffer에 세포를 재현탁합니다. 107 cells당 10 μL의 magnetic CD4 microbeads를 추가합니다. 4°C에서 15분 동안 세포를 배양합니다. 최적의 결과를 얻으려면 배양 중 5분마다 세포 현탁액을 부드럽게 혼합하십시오.
- 세포가 배양하는 동안 마그네틱 스탠드에 분리 컬럼을 놓습니다. 컬럼을 2mL의 버퍼로 미리 적십니다.
- 세포/비드 배양이 끝나면 5mL의 완충액으로 세포를 세척하고 350 x g에서 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 폐기합니다.
- 1mL의 완충액에 세포를 재현탁하고 샘플을 세포 분리 컬럼에 로드한 다음 통과시킵니다. 15mL 원심분리 튜브를 사용하여 CD4-세포 분획을 수집합니다. 건조되기 전에 물통을 세척하기 위해 1mL의 버퍼를 추가합니다. 세탁 단계를 2회 반복합니다.
- 마그네틱 스탠드에서 세포 분리 컬럼을 제거하고 새 15mL 원심분리 튜브에 놓습니다. 세포 분리 컬럼에 2mL의 세포 분리 완충액을 추가하고 플런저를 단단히 적용하여 세포를 컬럼 밖으로 밀어냅니다.
- 분획을 350 x g에서 4°C에서 5분 동안 원심분리하여 CD4+ 세포를 얻습니다. 상등액을 버리십시오.
4. 형광 활성화 세포 분류 및 THGM 분화에 의한 Naive CD4+ T 세포(CD4+CD25-CD44loCD62Lhi)의 정제
- 얻어진 CD4+ 세포 펠릿을 500μL의 완충액에 재현탁합니다. CD4-PerCp(2.8μg/mL), CD44-APC(2.4μg/mL), CD25-PE(2μg/mL) 및 CD62L-FITC(10μg/mL)를 포함하는 형광 접합 항체 혼합물과 세포를 혼합합니다(표 1). 얼음 위에서 세포를 20-30분 동안 배양하면서 빛으로부터 세포를 보호합니다.
메모: 항체의 농도는 이전에 실험실에서 최적화되었습니다. 나열된 항체의 수는 1-2 마우스의 세포에 대한 것입니다.
- 배양 후 5mL의 완충액으로 세포를 세척하고 4°C에서 5분 동안 350 x g에서 세포를 원심분리합니다.
- 상층액을 버리고 세포를 500μL의 완충액에 재현탁합니다. 나일론 메쉬를 사용하여 셀을 다시 필터링합니다.
- 세포 분류를 위해 세포 현탁액을 FACS 튜브로 옮깁니다. 수집 FACS 튜브를 500μL의 완충액으로 사전 코팅합니다.
- FACS 분류를 통해 CD4+CD25-CD44loCD62Lhi 집단(나이브 CD4+ T 세포)을 구합니다. 먼저 CD4+CD25-를 게이트한 다음 이 모집단에서 CD44loCD62Lhi cells를 선택합니다.
- naive CD4+ T 세포 분획을 새로운 15mL 원심분리 튜브에 모읍니다. 350 x g에서 4°C에서 5분 동안 세포를 원심분리하고 상층액을 버립니다.
- 50μM β-메르캅토에탄올을 함유한 완전한 RPMI 배지에서 naive CD4+ T 세포를 106 cells/mL 농도로 재현탁합니다.
- 48웰 플레이트에서 프리코팅에 사용되는 항-CD3e 항체를 흡인합니다. IL-7(2ng/mL), anti-CD28(1μg/mL) 및 anti-IFNγ(10μg/mL)로 각 웰에 0.25만(250μL) 세포를 시딩합니다(표 1).
메모: 사이토카인과 항체의 농도는 THGM 세포 분화를 위해 이전에 실험실에서 최적화되었습니다.
- 37 ° C에서 5 % CO2로 3 일 동안 세포를 배양합니다. 배양 중에 배지를 변경하지 마십시오.
5. In vitro에서 생성된 마우스 THGM 세포 분석
- 현미경을 사용하여 분화 후 세포 분화 3d를 확인합니다. 세포를 채취하고 350 x g에서 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다. 완전한 RPMI 배지로 세포를 2회 세척합니다.
메모: 분화된 세포는 naive CD4+ T cell보다 크기가 큽니다.
- 1mL의 완전한 RPMI 배지에 세포를 재현탁합니다. 10μL의 세포 현탁액을 10μL의 트리판 블루와 잘 혼합하여 혈구계로 세포 수를 측정합니다. 분화된 세포를 재회복 및 분석을 위해 3개의 물약으로 나눕니다.
메모: 세포 내 사이토카인 염색에는 ≥50만 개의 세포가 필요합니다.
- 세포 내 사이토카인 염색의 경우, 단백질 수송 억제제(1 μL/mL)가 있는 상태에서 4-6시간 동안 phorbol 12-myristate 13-acetate(PMA)(100ng/mL) 및 ionomycin(1μg/mL)으로 세포를 재충전합니다.
- 세포를 채취하여 30분 동안 항-CD4 항체(PerCP-conjugated, 0.2 mg/mL, 1:100 dilution; 또는 FITC-conjugated, 0.5 mg/mL, 1:100 dilution)로 염색합니다.
- 200μL의 고정 버퍼로 20-60분 동안 세포를 고정합니다. 고정 후 투과화 완충액 2mL로 세포를 1x 세척합니다.
- GM-CSF(PE 접합, 0.2 mg/mL, 1:100 희석), IL-17A(FITC 접합, 0.5 mg/mL, 1:100 희석)에 대한 항체로 세포 내 염색을 수행합니다. APC-conjugated, 0.2 mg/mL, 1:100 희석), IL-4 (APC-conjugated, 0.2 mg/mL, 1:100 dilution) 및 IFNγ (APC-conjugated, 0.2 mg/mL, 1:100 dilution; PE 결합, 0.2 mg/mL, 1:100 희석) 어둠 속에서 30분 동안.
표 1: 사용된 사이토카인 및 항체.
초
초
| 이름 | 재고 집중도 | 작업 집중 | 희석 | 500 μL 염색 완충액의 부피 |
| CD4-PerCp | 0.2 mg/mL | 2.8 μg/mL | 1분 71 | 7 μL |
| CD44-APC(시세이하 | 0.2 mg/mL | 2.4 μg/mL | 1분 83 | 6 μL |
| CD25-PE | 0.2 mg/mL | 2 μg/mL | 1:100 | 5 μL |
| CD62L-핏씨 | 0.5 mg/mL | 10 μg/mL | 오전 1:50 | 10 μL |
| GM-CSF-PE | 0.2 mg/mL | 2 μg/mL | 1:100 | |
| IL-17A-FITC | 0.5 mg/mL | 5 μg/mL | 1:100 | |
| IL-17A-APC | 0.2 mg/mL | 2 μg/mL | 1:100 | |
| IFNγ-APC | 0.2 mg/mL | 2 μg/mL | 1:100 | |
| IFNγ-PE | 0.2 mg/mL | 2 μg/mL | 1:100 | |
| IL-4-APC | 0.2 mg/mL | 2 μg/mL | 1:100 | |
| CD4-핏씨 | 0.5 mg/mL | 5 μg/mL | 1:100 | |
| 일리노이 -7 | 20 μg/mL | 2ng/mL | 1:10000 | |
| 안티 CD28 | 0.5 mg/mL | 1 μg/mL | 1:500h | |
| 안티 IFNγ | 1 밀리그램 / mL | 10 μg/mL | 1:100 | |