쥐 강아지 뇌에서 미세아교세포의 자기 분리(Magnetic Isolation of Microglia from Mouse Pup Brains)

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 뇌 해리 및 자기 미세아교세포 격리

참고: 모든 세포 조작 및 재현탁은 1,000 μL 파이펫으로 매우 주의해서 수행해야 합니다. 높은 기계적 작용을 가하면 미세아교세포가 활성화되거나 죽을 수 있습니다.

1. 표 1에 따라 해리 혼합물을 포함하는 해리관당 12개의 뇌 조각(~1.2g)을 전달합니다. 24마리의 새끼의 경우 4개의 C-튜브가 필요합니다(그림 1A-B).
2. 디스해리터에 C-튜브를 놓습니다(가열 모드 사용). 제조업체의 지침에 따라 장비에서 최적화된 NTDK 프로그램을 시작합니다(그림 1D).
3. 300 x g에서 20초(4°C에서) 동안 원심분리기를 사용하여 모든 세포를 수집합니다. 1,000 μL 피펫으로 위아래로 세 번 피펫팅하여 기계적 해리를 완료합니다(그림 1E).
4. 세포를 4개의 15mL 튜브 + 스트레이너로 옮깁니다. Ca¹⁺ 및 Mg²⁺(HBSS+/+)가 포함된 1x Hanks' Balanced Salt Solution(HBSS) 10mL로 스트레이너를 헹굽니다(그림 1F).
5. 300 x g에서 10분(4°C에서) 원심분리기를 하고 상층액을 제거합니다. 펠릿을 HBSS+/+ 10mL로 조심스럽게 재현탁합니다(그림 1G).
6. 300 x g에서 10분(4°C에서) 원심분리기를 하고 상층액을 제거합니다. 6mL의 분류 버퍼(1x PBS + 0.5% BSA)로 펠릿을 조심스럽게 재현탁합니다(그림 1H).
7. 300 x g에서 10분(4°C에서) 원심분리기를 하고 상층액을 제거합니다. 튜브당 200μL의 CD11b-마이크로비드 용액을 추가하고 조심스럽게 재현탁합니다(그림 1I).
8. 4°C에서 15-20분 동안 튜브를 배양합니다. 6mL의 분류 버퍼로 펠릿을 조심스럽게 재현탁합니다(그림 1I-J).
9. 300 x g에서 10분(4°C에서) 원심분리기를 하고 상층액을 제거합니다. 8mL의 분류 버퍼로 펠릿을 조심스럽게 재현탁합니다(그림 1K).
10. 분리기에 대한 POSSEL 프로그램(재료 표 참조)에 따라 8개의 열을 준비합니다. 컬럼에서 1 mL x 1 mL 세포를 이동합니다. 다른 mL를 추가하기 전에 모든 세포가 통과할 때까지 기다립니다. CD11b+ 세포를 1mL의 분류 버퍼가 있는 멸균 용출 플레이트에서 용리합니다(그림 1L).
11. CD11b+ 세포를 새로운 50mL 튜브에 풀링합니다(그림 1M).
12. 300 x g에서 10분(4°C에서) 원심분리기를 하고 상층액을 제거합니다. 10mL의 차가운 마이크로아교세포(대식세포 무혈청 배양 배지(SFM) + 페니실린-스트렙토마이신(P/S) 1%)으로 펠릿을 조심스럽게 재현탁합니다(그림 1N).
13. CD11b+ 세포를 계산합니다. P8에서는 뇌당 ~650,000개의 세포를 얻어야 합니다.
    메모: 본 프로토콜에서, 세포는 자동화된 세포 계수기를 사용하여 계수되었습니다(재료 표 참조).
14. 저온 미세아교세포 배지에서 세포를 최종 농도 650,000-700,000 cells/mL까지 재현탁시키고 세포 배양 플레이트에 분배합니다.
    메모: 6웰 플레이트는 웨스턴 블롯(웰당 2mL)용입니다. 12웰 플레이트는 RT-qPCR 분석(웰당 1mL)용이고 96웰 플레이트는 식세포 분석(웰당 250μL)용입니다.

표 1: 해리 혼합물의 준비.

그림 1: 뇌 해리 및 미세아교세포 분리의 개략도. (에이씨) P8 마우스의 뇌를 해부하고 후각구와 소뇌를 제거한 후, 뇌는 먼저 HBSS+/+가 있는 페트리 접시로 옮겨졌고, 그 다음에는 해리 혼합물이 들어 있는 해리관으로 옮겨졌습니다. C-튜브를 해리레이터(가열 모드 사용)에 놓고 NTDK 프로그램을 시작했습니다(D). (E) 프로그램 종료 시, 튜브를 300 x g에서 4°C에서 20초 동안 원심분리했습니다. 그런 다음 1,000 μL 피펫으로 위아래로 세 번 피펫팅하여 해리를 완료했습니다. (F) 그런 다음 세포를 15mL 튜브 + 70μm의 스트레이너로 옮기고 10mL의 HBSS+/+로 헹굽니다. (G) 샘플을 4°C에서 10분 동안 300 x g에서 원심분리하고, 상등액을 제거하고, 펠릿을 10mL의 HBSS+/+로 재현탁시켰다. (H) 튜브를 4°C에서 10분 동안 300 x g에서 다시 원심분리했습니다. 상등액을 제거한 다음 펠렛을 6mL의 분류 완충액에 재현탁시켰습니다. (I) 튜브를 300 x g에서 4°C에서 10분 동안 원심분리한 후 상층액을 제거하고 CD11b-마이크로비드(200μL) 용액을 첨가했습니다. 튜브를 4°C에서 15-20분 동안 배양한 후 6mL의 분류 완충액(J)에 재현탁하고 4°C에서 10분 동안 300 x g에서 원심분리했습니다. (K) 상등액을 제거하고 펠렛을 8mL의 분류 완충액에 조심스럽게 재현탁시켰습니다. (L) 그런 다음 separator에서 POSSEL 프로그램을 실행하여 column을 준비합니다. 세포를 컬럼에서 1 mL x 1 mL로 옮기고, CD11b 세포를 1 mL의 분류 완충액이 있는 멸균 용출판에서 용출시켰다. (M) CD11b 세포를 새로운 50 mL 튜브에 모으고 4 °C에서 10 분 동안 300 x g에서 원심 분리 한 후 상층액을 제거했습니다. (N) 펠릿을 마지막 단계에서 10mL의 저온 마이크로아교세포(microglia) 배지에 조심스럽게 재현탁시켰다. 세포를 계수하고 미세아교세포 배지에서 세포 배양 플레이트에 분배된 650,000-700,000 cells/mL의 최종 농도로 희석했습니다.